[发明专利]利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法

摘要

利用鱼类血细胞监测海水中苯并a芘的方法。取50μL经缓冲液在冰上处理好的金黄色葡萄球菌悬液与暴露于含有苯并a芘海水中的牙鲆红细胞悬液等体积混合，细胞数的比为20∶1，20℃恒温孵育30min。其间每隔10min摇动混匀，防止沉淀。孵育完成后终止反应。每管加入20μL预冷的0.25％的戊二醛溶液，4℃冰箱中固定15min。取孵育液涂片，晾干后甲醇固定。每张涂片经Wright’s染液染色3min，用蒸馏水冲洗至无色为止。晾干后油镜下观察计算红细胞C3b受体花环率。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌为一个花环。检测方法在1h内完成，可以较好的监测分析海水是否受到苯并a芘的污染。

主权项

利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法，其特征在于具体的检测分析方法：(1)将金黄色葡萄球菌用0.1mol/L PBS缓冲液离心洗涤3次，并调整成浓度为2×108CFU/mL的菌悬液，4℃保存备用；(2)取50μL金黄色葡萄球菌悬液分别与在正常海水和含有苯并a芘海水养殖的牙鲆的红细胞悬液等体积混合，细胞数比例约为20∶1，轻轻混匀后，于20℃恒温孵育30min；(3)孵育过程中每隔10min轻轻摇动混匀，防止红细胞和菌体细胞沉淀；(4)孵育完成后，于冰上终止反应。每管加入20μL预冷的0.25％的戊二醛溶液，4℃固定15min。取适量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定2min；(5)每张涂片加入适量的Wright’s染液染色3min，用蒸馏水冲洗至水流无色。晾干后油镜下观察红细胞对抗原的免疫粘附，计算红细胞C3b受体花环率；(6)每个样品涂3张片观察计数取平均值。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌记为一个花环；(7)0.1mol/L PBS++实验组中200个红细胞中形成的花环数记为x1，0.1mol/LPBS‑EDTA阴性对照组中200个红细胞中形成的花环数记为x2；(8)红细胞C3b受体花环率＝(x1‑x2)/200×100％。实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计学分析；所述金黄色葡萄球菌悬液的制备方法是：将金黄色葡萄球菌单菌落于LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。用0.1M PBS缓冲液离心洗涤两次，用终浓度1％的福尔马林溶液65℃水浴40min将其灭活。取金黄色葡萄球菌悬液300μL于2mL灭菌离心管中，加入等体积牙鲆血清，冰上充分混匀后，于20℃孵育30min。孵育完成后，4℃条件下10000rpm离心5min，菌体沉淀用300μL相应缓冲液重悬，恢复至原来的菌悬液浓度，4℃保存备用；所述反应中所用缓冲液及其它液体为：PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4‑12H2O 2.9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4；牙鲆血清稀释10倍。