[发明专利]利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法

权利要求书

1.利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法，其特征在于具体的检测分析方法：

(1)将金黄色葡萄球菌用0.1mol/L PBS缓冲液离心洗涤3次，并调整成浓度为2×10⁸CFU/mL的菌悬液，4℃保存备用；

(2)取50μL金黄色葡萄球菌悬液分别与在正常海水和含有苯并a芘海水养殖的牙鲆的红细胞悬液等体积混合，细胞数比例约为20∶1，轻轻混匀后，于20℃恒温孵育30min；

(3)孵育过程中每隔10min轻轻摇动混匀，防止红细胞和菌体细胞沉淀；

(4)孵育完成后，于冰上终止反应。每管加入20μL预冷的0.25％的戊二醛溶液，4℃固定15min。取适量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定2min；

(5)每张涂片加入适量的Wright’s染液染色3min，用蒸馏水冲洗至水流无色。晾干后油镜下观察红细胞对抗原的免疫粘附，计算红细胞C3b受体花环率；

(6)每个样品涂3张片观察计数取平均值。将每个红细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌记为一个花环；

(7)0.1mol/L PBS⁺⁺实验组中200个红细胞中形成的花环数记为x₁，0.1mol/LPBS-EDTA阴性对照组中200个红细胞中形成的花环数记为x₂；

(8)红细胞C3b受体花环率＝(x₁-x₂)/200×100％。实验结果采用SPSS 13.0软件进行统计学分析；

所述金黄色葡萄球菌悬液的制备方法是：将金黄色葡萄球菌单菌落于LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。用0.1M PBS缓冲液离心洗涤两次，用终浓度1％的福尔马林溶液65℃水浴40min将其灭活。取金黄色葡萄球菌悬液300μL于2mL灭菌离心管中，加入等体积牙鲆血清，冰上充分混匀后，于20℃孵育30min。孵育完成后，4℃条件下10000rpm离心5min，菌体沉淀用300μL相应缓冲液重悬，恢复至原来的菌悬液浓度，4℃保存备用；

所述反应中所用缓冲液及其它液体为：

PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄-12H₂O 2.9g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.4；牙鲆血清稀释10倍。

2.根据权利要求1所述利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法，其特征在于步骤(2)中，将暴露于苯并a芘污染海水中的鱼类血细胞与金黄色葡萄球菌悬液混匀孵育，于20℃恒温孵育30min，轻微摇动。