[发明专利]利用鱼类血细胞监测海水苯并a芘污染的方法

说明书

技术领域

本发明属于本发明涉及基于鱼类血细胞免疫粘附活性变化的海水有毒有机污染物的检测方法。

背景技术

近年来，随着科学技术的进步和工农业生产的发展，越来越多人工合成的有毒有机污染物(包括石油烃、多氯联苯、有机氯农药、多环芳烃、三丁基锡等)在近岸海水、沉积物和海洋生物体内普遍检出，有机污染问题日渐突出，已成为世界各国科学界和政府关注的新热点。研究表明，有毒有机污染物毒性大，容易溶解在生物有机相中，在海洋生物体内高度富集，破坏海洋生物的遗传物质，影响海洋生物的繁殖能力，改变受污染水域的海洋生物的种群组成，导致海洋生态系统失调，而且可通过鱼类、贝类及其它海产品进入人体，危及人类健康。因此，国内外研究学者越发关注海洋中有毒有机化合物的污染监测及其潜在危害。

对于海洋中有毒有机化合物的监测，主要有化学监测和生物监测两种方法，其中化学监测法主要通过液-液萃取方法，富集海水中有毒有机化合物，通过测定萃取液中有机化合物的量来反映它们对海洋环境的污染程度，包括荧光分光光度法¹、紫外分光光度法、气相色谱-质谱联用(GC-MS)联用技术等²。生物监测方法主要是利用海洋底栖生物贻贝、蛤、蚝等滤食性贝类体内有机污染物的残留水平来反映背景水体中各种有毒有机污染物质含量³。但在实际海洋有毒有机污染物监测过程，化学监测方法相对繁琐，并且检测灵敏度越高所需仪器价格就越贵，因此在地方基层海洋环境监测单位不容易推广。生物监测方法则主要以底栖贝类作为指示物种，并不能真实反映表层海水中的有机污染情况。因此以鱼类作为有毒有机污染物的指示物种，建立一种相对灵敏而便捷的检测分析方法，对于丰富海水中有毒有机污染物检测方法、完善海水水质检测标准具有重要意义。

参考文献

1.韦蔓新，何本茂.钦州湾近20a来水环境指标变化趋势II油类的分布特征及其污染状况.海洋环境科学，2003，22(2)：49-52.

2.江桂斌，徐福正，何滨等.有机锡化合物测定方法研究进展.海洋环境化学，1999，18(3)：61-68.

3.刘仁沿，吴世培，王斌.长江口以北沿海主要经济贝类中有机氯农药和多氯联苯的分布及评价.海洋环境科学，1996，15(3)：29-35.

发明内容

本发明旨在建立一种基于不同海水环境条件下牙鲆血细胞免疫粘附活性变化的快速监测海水中苯并a芘污染的方法。通过在正常海水和含苯并a芘海水中牙鲆的血细胞对金黄色葡萄球菌的免疫粘附活性的变化，初步建立研究分析海水中苯并a芘的污染情况及其毒性效应的实验方法。在0.1mol/L PBS⁺⁺缓冲液体系中，分别采集养殖在正常海水和含苯并a芘海水中的牙鲆血细胞，与金黄色葡萄球孵育，观察计算鱼类血细胞免疫粘附金黄色葡萄球菌形成C3b受体花环的百分率。将每个血细胞粘附两个及两个以上金黄色葡萄球菌记为一个花环，计数200个血细胞，算出花环阳性细胞百分率。血细胞C3b受体花环率＝成花环细胞数/200×100％。

具体方法和步骤为：

1.牙鲆血清和菌悬液的制备：

用无菌注射器分别从实验牙鲆的尾静脉采血，注入5mL离心管中，平放于桌面上，室温放置30min。待血凝固后，放于4℃冰箱中过夜。吸出析出的血清，分装于1.5mL灭菌离心管中，-80℃保存备用。取处理好的金黄色葡萄球菌悬液300μL于2mL灭菌离心管中，加入等体积牙鲆血清，冰上充分混匀后，于20℃孵育30min。每隔10min轻轻混匀一次，防止菌体沉淀。孵育完成后，4℃条件下10000rpm离心5min，菌体沉淀用300μL相应缓冲液重悬，恢复至原来的菌悬液浓度，4℃保存备用。

2.牙鲆红细胞的制备：

从实验牙鲆的尾静脉取血，采用阿氏抗凝剂与牙鲆外周血1∶1混合。利用比重为1.083的淋巴细胞分离液(TBD公司)分离制备牙鲆红细胞。将最底层的红细胞沉淀用0.1M PBS于4℃下离心洗涤两次，用血球计数板计数后调整浓度至1×10⁷/mL。然后取适量红细胞用缓冲液于4℃离心洗涤两次，恢复至1×10⁷/mL。

3.红细胞免疫粘附活性的检测：