[发明专利]禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种高效率、敏感性高的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。该方法利用两套PCR引物（1对外侧引物和1对内侧引物）进行两轮PCR扩增的方法，即将外侧引物进行PCR扩增后的产物作为内侧引物进行PCR扩增的模板，内侧引物与模板DNA的结合位点处于外侧引物扩增出的DNA片段内侧，套式PCR对减少或消除非特异性扩增及提高灵敏度非常有效。本发明相比于普通检测方法难以检测到的浓度极低的模板（1个或数个copies），能大大增加扩增的效率和忠实性，对环境样品中极微量靶基因的扩增非常有效，十分有利于鱼类养殖水体中的禽流感病毒微量模板的扩增，能完全满足鱼塘养殖用水中禽流感病毒检测的敏感性和特异性的要求。

主权项

一种禽流感病毒通用型套式荧光RT‑PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A：取待测样品提取模板RNA；B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT‑PCR，所述外引物（P1、P2）的序列分别为：P1：5’‑TATTAGCAAAAGCAGGGTA‑3’P2：5’‑GTAGTAGAAACAAGGGTATT‑3’；   C：以上述一步法RT‑PCR产物为模板，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物（P3、P4）及探针序列分别为：      P3：5’‑CGGACGAAAAGGCAACGA‑3’       P4：5’‑CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT‑3’       探针：Fam‑5’‑CGATCGTGCCTTCCTTTGACA‑3’‑Eclipse；   D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。