[发明专利]禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：取待测样品提取模板RNA；

B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT-PCR，所述外引物（P1、P2）的序列分别为：

P1：5’-TATTAGCAAAAGCAGGGTA-3’

P2：5’-GTAGTAGAAACAAGGGTATT-3’；

   C：以上述一步法RT-PCR产物为模板，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物（P3、P4）及探针序列分别为：

      P3：5’-CGGACGAAAAGGCAACGA-3’

       P4：5’-CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT-3’

       探针：Fam-5’-CGATCGTGCCTTCCTTTGACA-3’-Eclipse；

   D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。

2.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为：50℃ 30min，94℃ 3min，1个循环；94℃ 60s，53℃ 60s，72℃ 120s，30个循环；72℃延伸8min。

3.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤C中荧光PCR的反应参数为：94℃ 10s，45℃ 30 s，72℃ 60s，3个循环；94℃ 10s，58℃ 35s，45个循环后收集荧光。

4.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中阳性对照设立方法为：选取禽流感病毒RNA为模板，经过克隆筛选正确的重组克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度稀释后作为阳性对照。

5.根据权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤B中采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。

6.一种用于权利要求1所述的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

 所述一步法RT-PCR反应体系的组分包括：10μmol/L的外引物P1 0.5μL，10μmol/L的外引物P2 0.5μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0μL，2×1 Step Buffer 10.0μL，模板RNA溶液 2.0μL，DEPC H2O 6.0μL；

所述荧光PCR反应体系包括如下组分： 

1×RT-PCR缓冲液     含10 mmol/L Tris-Cl，50 mmol/L KCl，pH8.3

dNTPs               0.2 mmol/L each

MgCl2               2.5 mmol/L

DTT 2 mmol/L

甘油   5%

Ex TagDNA酶        1 U/μL

内引物P3            0.9 μmol/L

内引物P4  0.9 μmol/L

探针                0.25 μmol/L。