[发明专利]禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒的分离鉴定需要从禽鸟采集咽喉拭子或泄殖腔拭子，或从发病及死亡禽鸟采集内脏器官，用鸡胚进行病毒分离培养，再鉴定血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），最后通过鸡人工感染进行致病力的测定，这种经典的禽流感病毒检测方法因敏感性高，被OIE推荐为国际参考方法，但由于诊断周期长，且需要在生物安全三级实验室中进行，因此不能用于快速检测，而现有的禽流感病毒检测方法，如常规RT-PCR技术、胶体金免疫检测和ELISA等因敏感性较低，不能直接用于禽类和禽类产品的AIV检测。

特别在鱼类养殖水体中的禽流感病毒（avian influenza viruses，AIV）含量十分低，其含量远远低于普通禽类组织，禽流感病毒的检测较普通禽类组织困难许多，现有的较为敏感的鸡胚病毒分离，以及常规的RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）及荧光RT-PCR (real-time RT-PCR)检测方法均无法满足鱼类养殖水体禽流感病毒快速检测和高敏感性的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效率、敏感性高的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案是：本发明涉及的禽流感病毒通用型套式荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

A：取待测样品提取模板RNA；

B：设立阳性对照和阴性对照，按照配置好的反应体系，用外引物（P1、P2）进行一步法RT-PCR，所述外引物（P1、P2）的序列分别为：

P1：5’-TATTAGCAAAAGCAGGGTA-3’

P2：5’-GTAGTAGAAACAAGGGTATT-3’；

   C：以上述一步法RT-PCR产物为模板，将内引物（P3、P4）及探针和反应组分置于荧光PCR仪中进行荧光PCR扩增反应，所述内引物（P3、P4）及探针序列分别为：

      P3：5’-CGGACGAAAAGGCAACGA-3’

       P4：5’-CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT-3’

       探针：Fam-5’-CGATCGTGCCTTCCTTTGACA-3’-Eclipse；

   D：反应结束后，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。

为了提高荧光PCR反应的灵敏度和特异性，确定最佳退火温度和PCR循环次数，上述步骤B中一步法RT-PCR的反应参数为：50℃ 30min，94℃ 3min，1个循环；94℃ 60s，53℃ 60s，72℃ 120s，30个循环；72℃延伸8min。

上述步骤C中荧光PCR的反应参数为：94℃ 10s，45℃ 30 s，72℃ 60s，3个循环；94℃ 10s，58℃ 35s，45个循环后收集荧光。

所述步骤B中阳性对照设立方法为：选取禽流感病毒RNA为模板，经过克隆筛选正确的重组克隆质粒，然后抽取所述重组克隆质粒对目的片段进行体外反转录，按一定浓度稀释后作为阳性对照；采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF鸡胚的尿囊液作为阴性对照。

本发明所涉及的检测试剂盒包括RNA提取试剂、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂、质粒抽提试剂和PCR反应体系试剂等，其中的PCR反应体系包括一步法RT-PCR反应体系和荧光PCR反应体系；

 所述一步法RT-PCR反应体系的组分包括：10μmol/L的外引物P1 0.5μL，10μmol/L的外引物P2 0.5μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1.0μL，2×1 Step Buffer 10.0μL，模板RNA溶液 2.0μL，DEPC H2O 6.0μL；

所述荧光PCR反应体系包括如下组分： 

1×RT-PCR缓冲液     含10 mmol/L Tris-Cl，50 mmol/L KCl，pH8.3

dNTPs               0.2 mmol/L each

MgCl2               2.5 mmol/L

DTT                2 mmol/L

甘油               5%