[发明专利]一种人源性抗核抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种人源性抗核抗体的制备方法，包括以下步骤：收集自身免疫病患者外周血单个核细胞，抽提总RNA，反转录获取cDNA文库；以获取的cDNA文库为模版，PCR法扩增轻链k、l基因及免疫球蛋白分子重链Fd基因；将轻链k、l基因克隆入pComb3Hss载体，构建轻链文库；将重链Fd基因载入载体，构建完成组合文库；将所得重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue，用辅助噬菌体M13KO7感染，随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面，完成噬菌体表面展示；利用亲和层析柱纯化人源性抗核抗体Fab片段。本发明克服了随机组合抗体库随机性强、筛选工作量大及不容易获得特异性抗体的缺点，能从噬菌体抗体库中直接筛选出特异性抗体，方法简单易行，缩短了实验周期。

主权项

一种人源性抗核抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(a) 收集自身免疫病患者外周血单个核细胞，抽提总RNA，反转录获取cDNA文库；(b) 以获取的cDNA文库为模版，PCR法扩增轻链k、l基因及免疫球蛋白分子重链Fd基因；(c) 将轻链k、l基因克隆入pComb3Hss载体，构建轻链文库；(d) 将重链Fd基因载入步骤c所得载体，构建完成组合文库；(e) 将步骤d所得重组质粒转化大肠杆菌XL1‑Blue，用辅助噬菌体M13KO7感染，随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面，完成噬菌体表面展示；(f) 通过4轮淘筛，富集已构建的人源性抗核抗体Fab噬菌体抗体库，间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab噬菌体抗体，提取阳性克隆的噬菌粒DNA，切除gIII基因片段，自连接后转化大肠杆菌XL1‑Blue，以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段；应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达产物进行鉴定；(g) 利用亲和层析柱纯化人源性抗核抗体 Fab片段。