[发明专利]一种人源性抗核抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，特别是一种人源性抗核抗体的制备方法。 

背景技术

肿瘤是当前人类健康与生命的最大威胁，发生率有增无减，死亡率已跃居诸病种之首，主要采用手术、放疗、化疗等手段进行治疗，但仍然无法获得满意的疗效。肿瘤坏死治疗是近来兴起的一种新疗法，属于放射免疫治疗的范畴，其基本原理是利用肿瘤组织的微血管内皮细胞的不连续性，基底膜的不完整性和肿瘤细胞膜的高通透性特点，应用能与细胞内核抗原成份结合的靶向分子携带杀瘤物质，滞留或定位于肿瘤组织内，造成肿瘤的特异性杀伤。瘤细胞杀伤后释出的靶向分子又可进入相邻的瘤组织造成进一步的杀伤，如此使杀瘤范围不断扩大，直至正常组织死亡。该疗法的关键是获得能与细胞内核抗原成份特异性结合的抗体，目前常用的方法是通过人鼠杂交瘤技术获得针对肿瘤坏死组织的单克隆抗体，例如Peregrine开发的肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗(chTNT)。但是，应用该法制备单抗用于放射免疫治疗存在如下缺陷：第一，其作为一种鼠/人嵌合单抗仍然存在较为严重的宿主抗体反应，不宜多次应用；第二，制备技术比较繁杂的，难度大要求高，成功率低；第三，目前获得的单抗分子量大，组织穿透性较差，不利于把杀瘤物质带入肿瘤内部；第四，由于其针对的是肿瘤坏死组织，抗原组分较为复杂，因此其特异性较差。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种方法相对简便、投入成本较少、成功率高的人源性单克隆抗核抗体的制备方法，所制得的人源性单克隆抗核抗体可以较好应用于肿瘤坏死治疗。 

一种人源性抗核抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 

(a)收集自身免疫病患者外周血单个核细胞，抽提总RNA，反转录获取cDNA文库； 

(b)以获取的cDNA文库为模版，PCR法扩增轻链κ、λ基因及免疫球蛋白分子重链Fd基因； 

(c)将轻链κ、λ基因克隆入pComb3Hss质粒，构建轻链文库； 

(d)将重链Fd基因载入步骤c所得质粒，构建完成组合文库； 

(e)将步骤d所得重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue，用辅助噬菌体M13KO7感染，随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面，完成噬菌体表面展示； 

(f)通过4轮淘筛，富集已构建的人源性抗核抗体Fab噬菌体抗体库，间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab噬菌体抗体，提取阳性克隆的噬菌粒DNA，切除gIII基因片段，自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue，以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段；应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达产物进行鉴定； 

(g)利用亲和层析柱纯化人源性抗核抗体Fab片段。 

进一步地，自身免疫病患者血中抗核抗体的滴度大于1∶10000(使用间接免疫荧光法检测)。 

进一步地，步骤b中，PCR法扩增使用的引物序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示： 

①重链可变区5′端引物VH4f： 

5′-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3′；(SEQ ID No.1) 

②重链可变区5′端引物VH1a： 

5′-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG-3′；(SEQ ID No.2) 

③重链IgG1(Fd)3′端引物CG1Z： 

5′-GCATGTACTAGTTTTGTCCCAAGATTTGGG-3′；(SEQ ID No.3) 

④重链IgG3(Fd)3′端引物CG3Z： 

5′-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-3′；(SEQ ID No.4) 

⑤轻链(κ)可变区5′端引物Vκ3a： 

5′-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3′；(SEQ ID No.5) 

⑥轻链(λ)可变区5′端引物VL4： 

5′-TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG-3′；(SEQ ID No.6) 

⑦轻链(κ)恒定区3′端引物Cκ1Z： 

5′-GCGCCGTCTAGAAACACTCTCCTCTGTTGAAG 

CTCTTTGTGACGGATCTCAG-3′；(SEQ ID No.7) 

⑧轻链(λ)恒定区3′端引物CL2：