[发明专利]一种人源性抗核抗体的制备方法

权利要求书

1.一种人源性抗核抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(a) 收集自身免疫病患者外周血单个核细胞，抽提总RNA，反转录获取cDNA文库；

(b) 以获取的cDNA文库为模版，PCR法扩增轻链k、l基因及免疫球蛋白分子重链Fd基因；

(c) 将轻链k、l基因克隆入pComb3Hss载体，构建轻链文库；

(d) 将重链Fd基因载入步骤c所得载体，构建完成组合文库；

(e) 将步骤d所得重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue，用辅助噬菌体M13KO7感染，随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面，完成噬菌体表面展示；

(f) 通过4轮淘筛，富集已构建的人源性抗核抗体Fab噬菌体抗体库，间接ELISA法鉴定4轮淘筛后抗核抗体Fab噬菌体抗体，提取阳性克隆的噬菌粒DNA，切除gIII基因片段，自连接后转化大肠杆菌XL1-Blue，以IPTG诱导表达可溶性人源性抗核抗体Fab片段；应用间接ELISA法及荧光免疫法对表达产物进行鉴定；

(g) 利用亲和层析柱纯化人源性抗核抗体 Fab片段。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤a中，自身免疫病患者血中抗核抗体的滴度大于1：10000。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b中，PCR法扩增使用的引物序列如SEQ ID No.1~ SEQ ID No.8所示：

重链可变区5′端引物VH4f：

5′-CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG-3′；（SEQ ID No.1）

重链可变区5′端引物VH1a：

5′-CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG-3′；（SEQ ID No.2）

重链IgG1(Fd)3′端引物CG1Z：

5′-GCATGTACTAGTTTTGTCCCAAGATTTGGG-3′；（SEQ ID No.3）

重链IgG3(Fd)3′端引物CG3Z：

5′-TGTGTGACTAGTGTCACCAAGTGGGGTTTT-3′；（SEQ ID No.4）

轻链（k）可变区5′端引物Vk3a：

 5′-GAAATTGAGCTCACGCAGTCTCCA-3′；（SEQ ID No.5）

轻链（l）可变区5′端引物VL4：

5′-TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG-3′；（SEQ ID No.6）

轻链（k）恒定区3′端引物Ck1Z：

5′-GCGCCGTCTAGAAACACTCTCCTCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGATCTCAG-3′；（SEQ ID No.7）

轻链（l）恒定区3′端引物CL2：

5′-CGCCGTCTAGAACTATGAACATTCTGTAGG-3′；（SEQ ID No.8）。