[发明专利]一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法

摘要

本发明涉及一种检测甘蔗矮化病病原菌的快速检测方法。本发明特征是：甘蔗样品采用液氮速冻研磨处理，根据甘蔗矮化病致病菌ITS序列，设计4条特异性引物，进行甘蔗矮化病病原菌的目的片段的环介导等温扩增。以甘蔗矮化病病原菌的环介导等温扩增的反应产物检测鉴定，在反应管中加入荧光染料GlodView，验币笔紫外光照射下肉眼观察进行判断。本发明检测方法可靠、灵敏度高，耗时短，成本低廉，使对甘蔗宿根矮化病的诊断准确、快速。不需要其他特殊仪器，操作简便，尤为适用田间检测甘蔗宿根矮化病的快速精确检测方法。

主权项

一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是：1）选取被检测甘蔗的离根部第3节的甘蔗茎，洗净表面杂质，去皮，70%乙醇擦拭消毒；2）将经消毒甘蔗切成小块，放入研钵中，加入100ml液氮速冻研磨至粉末状；3）将粉末10g，装入50ml离心管A中，加入20ml TE缓冲液，80℃水浴锅加热60 min ，离心10min，将上清液移至 50ml离心管B中；4）在离心管B中加入等体积的β巯基乙醇氯仿溶液，离心10min。取上清液15ml移至50ml离心管C中；5）在离心管C中加入等体积的氯仿溶液，离心10min，取上清液10ml移至50ml离心管D中；6）在上步装有上清液离心管D中，分别加入20ml的无水乙醇和1ml的醋酸钠，‑20℃静置30min；7）离心30min，倒去上清液，沉淀物用乙醇洗涤两次，在室温下干燥获得含有DNA的粉末物；8）在1.5ml离心管E中，加入干燥获得含有DNA的粉末物1mg，注入100μl已灭菌的去离子水，震荡溶解粉末物，作为LAMP扩增时的模板DNA；9）LAMP扩增：在装有LAMP扩增体系的0.2ml离心管中，加入1 μl模板DNA，混匀后，置于水浴锅中60℃‑65℃恒温加热进行扩增，扩增时间为60‑70min；10）检测产物鉴定：在扩增结束的离心管中加入1μl预稀释1000倍的荧光染料GlodView溶液。