[发明专利]一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法

说明书

技术领域

本发明是属于生物技术领域，具体涉及一种甘蔗矮化病病原菌的分子生物学的快速检测方法。

背景技术

甘蔗矮化病是影响甘蔗产量的重要病害之一，其病原菌是 Leifsonia xyli subsp.xyli (Lxx)，其致病机理是由于病原菌Lxx寄生于甘蔗(Saccharum officinale)的木质部中，分泌产生胶状物质，堵塞甘蔗的木质部导管，致使养分不能向上运输，造成甘蔗矮化，发育不良，甘蔗生长过程经常被误认为土壤肥力不足，管理不良等原因，造成误判。宿根种植甘蔗的矮化病病原菌感染率可以达到30%，造成甘蔗大幅减产。

对于病原菌Leifsonia xyli subsp.xyli的经典检测方法主要有解剖观察法，分离病菌法，血清学检测法等，这些检测方法操作烦琐，检测灵敏度也不高，均耗时长且假阳性率很高。目前流行的聚合酶链式反应（PCR）检测技术需要专门的仪器，而且存在样品间容易相互污染，操作繁琐等原因，荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）虽然能解决样品间相互污染问题，但是需要精密的仪器，检验的成本很高，难以在田间检测大规模推广。

LAMP（loop-mediated isothermal amplification）技术即是日本荣研化学株式会社在1998年独自开发成功的可替代PCR的基因扩增技术。特征为针对靶基因的6个序列区域设计4条特异性引物、利用链置换反应，在恒温条件下进行扩增反应。是一种“简易、快速、精确、低价”的基因扩增方法。随着科学技术发展，LAMP技术作为一种快速、简便的基因诊断方法。

甘蔗的矮化病病原菌Lxx的基因组研究表明：甘蔗矮化病病原菌Leifsonia xyli subsp.xyli 的16 S和23S RNA的基因间隔区（ITS）与其他细菌的ITS序列差异明显。因此，以ITS序列来设计特异性引物进行环介导等温扩增，检测甘蔗的矮化病病原菌Leifsonia xyli subsp.xyli。

发明内容

本发明目的是解决目前甘蔗矮化病病原菌检测技术的操作繁琐、特异性低耗时长的缺陷，研制一种检测甘蔗宿根矮化病的分子生物学快速精确检测方法。

检测甘蔗矮化病病原菌的方法的步骤是：

1、选取被检测甘蔗的离根部第3节的甘蔗茎，洗净表面杂质，去皮。70%乙醇擦拭消毒。

2、将经消毒甘蔗切成小块，放入研钵中，加入100ml液氮速冻研磨至粉末状。

3、将粉末10g，装入50ml离心管A中，加入20ml TE缓冲液，80℃水浴锅加热60min。离心10min。将上清液移至 50ml离心管B中。

4、在离心管B中加入等体积的β巯基乙醇氯仿溶液，离心10min。取上清液15ml移至50ml离心管C中。

5、在离心管C中加入等体积的氯仿溶液。离心10min。取上清液10ml至50ml离心管D中。

6、在装有上清液离心管D中，分别加入20ml的无水乙醇和1ml的醋酸钠，-20℃静置30min。

7、离心30min，倒去上清液，沉淀物用5ml 70%乙醇洗涤两次，在室温下干燥获得含有DNA的粉末物。.

8、在1.5ml的离心管E中，加入干燥获得含有DNA的粉末物1mg注入100μl去离子水，震荡溶解粉末物，作为LAMP扩增时的模板DNA预备液。

9、LAMP扩增：在0.2ml的离心管中，先后加入1 μl模板DNA预备液、1 μl  Bst聚合酶、0.25 μl浓度为20 μmol/L的引物F3、0.25 μl浓度为20 μmol/L的引物B3、1 μl浓度为20 μmol/L的引物FIP、1 μl浓度为20 μmol/L的引物BIP、3μl浓度为2.5 mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）、4 μl浓度为25 mmol/L的MgCl₂、2.5 μl 10×等温扩增缓冲液（ThermoPol Buffer）和11 μl的去离子水。混匀后，置于水浴锅中60-65℃加热进行恒温扩增，扩增时间为60-70min。

10、检测产物鉴定： 在扩增结束的离心管中加入1μl预稀释1000倍的荧光染料GlodView溶液。验币笔紫外光照射下肉眼观察进行判断。

本发明所述的离心管均为灭菌过的离心管，灭菌条件为121℃灭菌20min。

本发明所述的TE溶液成分为10mmol/l Tris-Cl 和1mmol/l EDTA。