[发明专利]一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法

权利要求书

1.一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是：

1）选取被检测甘蔗的离根部第3节的甘蔗茎，洗净表面杂质，去皮，70%乙醇擦拭消毒；

2）将经消毒甘蔗切成小块，放入研钵中，加入100ml液氮速冻研磨至粉末状；

3）将粉末10g，装入50ml离心管A中，加入20ml TE缓冲液，80℃水浴锅加热60 min ，离心10min，将上清液移至 50ml离心管B中；

4）在离心管B中加入等体积的β巯基乙醇氯仿溶液，离心10min。取上清液15ml移至50ml离心管C中；

5）在离心管C中加入等体积的氯仿溶液，离心10min，取上清液10ml移至50ml离心管D中；

6）在上步装有上清液离心管D中，分别加入20ml的无水乙醇和1ml的醋酸钠，-20℃静置30min；

7）离心30min，倒去上清液，沉淀物用乙醇洗涤两次，在室温下干燥获得含有DNA的粉末物；

8）在1.5ml离心管E中，加入干燥获得含有DNA的粉末物1mg，注入100μl已灭菌的去离子水，震荡溶解粉末物，作为LAMP扩增时的模板DNA；

9）LAMP扩增：在装有LAMP扩增体系的0.2ml离心管中，加入1 μl模板DNA，混匀后，置于水浴锅中60℃-65℃恒温加热进行扩增，扩增时间为60-70min；

10）检测产物鉴定：在扩增结束的离心管中加入1μl预稀释1000倍的荧光染料GlodView溶液。

2.根据权利要求1所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述的LAMP扩增体系是由1 μl  Bst聚合酶、0.25 μl浓度为20 μmol/L的引物F3、0.25 μl浓度为20 μmol/L的引物B3、1 μl浓度为20 μmol/L的引物FIP、1 μl浓度为20 μmol/L的引物BIP、3μl浓度为2.5 mmol/L的三磷酸脱氧核糖核苷、4 μl浓度为25 mmol/L的MgCl2、2.5 μl 10×等温扩增缓冲液和11 μl去离子水组成。

3.根据权利要求2所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述的引物F3序列为AACGGCTCGAACTTAGTACG。

4.根据权利要求2所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述的

引物B3序列为TCGCGTCCACTGTGTAGT。

5.根据权利要求2所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述的

引物FIP序列为GGACCCAACAGCGTGCATGTCCTGCTTGCAGGAAGGAAC。

6.根据权利要求2所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述

引物BIP序列为TCTGGACCTTTTTTGGTCGGCCTCTCAAAGTACGGGCGGTA。

7.根据权利要求1所述的一种检测甘蔗矮化病病原菌的方法，其特征是所述的β巯基乙醇氯仿溶液成分是β巯基乙醇：氯仿溶液=1：24。