[发明专利]一种通过基因工程重组技术制备血管钠肽(VNP)的方法

摘要

本发明公开了一种血管钠肽(VNP)的制备方法，为克服传统VNP化学合成法价格昂贵，生物活性低等缺陷，本发明在制备VNP过程中，用PCR技术扩增目的基因，以pGEX-4T-1为载体质粒酶切后定向插入VNP目的基因后形成重组质粒，以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株，以GST亲和柱分离目的蛋白，这种方法既能获得较高表达量的蛋白，又能通过亲和性得到较纯的蛋白。运用本发明技术获得的VNP比起化学合成法具有更好的生物学活性，且成本较化学合成法要低，为VNP进一步通过生物法生产奠定了基础。

主权项

血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于以下步骤：采用PCR技术将表达VNP的目的基因扩增，并纯化其产物；将纯化的PCR产物用EcoR I与Not I双酶切后定向插入经同样双酶切的pGEX‑4T‑1，获得重组质粒pGEX‑4T‑1‑VNP；将重组质粒pGEX‑4T‑1‑VNP转化至大肠杆菌JM 109，经培养扩增，抽提纯化，测序分析，获得序列正确的重组质粒；将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)菌，在30℃，0.5mM IPTG条件下表达重组蛋白；将表达重组蛋白的活化菌接种到LB+AMP的培养基中，进行摇瓶实验，工程菌在发酵罐中发酵，至OD600nm0.8时进行IPTG诱导，6小时后放罐，离心得到菌体；将离心后的菌体沉淀进行细胞破碎，破碎后离心收集上清液，进行GST亲和层析，洗脱得到融合蛋白GST‑VNP；将洗脱得到的融合蛋白GST‑VNP通过Sephadex G25凝胶过滤脱盐，后采用肠激酶切割。切割条件：25℃，pH 7.6，12小时；酶切后的产物再经GST亲和层析去掉GST标签，采用截留分子量为10000的超滤离心管对酶切后的样品进行纯化，去除少量的残余肠激酶，得到纯品VNP。将纯品VNP在大鼠上采用离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价。