[发明专利]一种通过基因工程重组技术制备血管钠肽(VNP)的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到生物领域，具体说是通过基因工程重组技术制备血管钠肽(VNP)的方法。

背景资料

心脑血管疾病是世界公认的人类健康的“第一杀手”，其中心力衰竭是多数器质性心脏病人如心肌梗死、肺源性心脏病、肥厚型心肌病等几乎不可避免的结局，心衰的2年死亡率达20％，5年死亡率高达40％。目前，我国心衰患者已达到500万人以上，随着人口老年化和高血压、高血脂、糖尿病和冠心病等患者的人数不断增加，在未来五年我国心衰患者预计将达到700万人以上。在我国临床上治疗心力衰竭的药物有强心剂、利尿剂、扩张血管剂、血管紧张素酶抑制剂、肾上腺素阻滞剂等几大类药物。但存在剂量不稳定、毒副作用大等缺点。因此开发一种效果优良、剂量稳定、毒副作用小的新药是非常迫切和必要的。近年来，通过对心衰发病过程及神经激素激活的研究，使人们逐渐认识到通过调节神经激素激活水平以改变心衰的发生、发展进程，才是治疗关键。

钠尿肽家族是近年来发现的一个多肽家族，具有由两个半胱氨酸通过二硫键形成的一个17个氨基酸的环形结构域。钠尿肽家族在维持机体水盐平衡、血压稳定、心血管及肾脏等器官功能方面具有重要意义。近年来，随着人们逐渐对钠尿肽家族成员的认识，利钠肽也成为了研究热点。人脑钠肽(human brain natriuretic peptide，hBNP)是钠尿肽家族成员之一，其基因重组药物--奈西利肽(nesiritide)已于2001年被美国FDA批准作为治疗急性失代偿性心力衰竭的临床用药。我国也于2005年上市了国家生物制品I类新药“新活素”(即rhBNP)，同样用于治疗急性充血性心衰。

天然钠尿肽主要包括ANP、BNP和CNP，它们都有一个二硫键形成的、由17个氨基酸残基构成的环，其中在人ANP氨基酸残基环的氮末端有6个氨基酸残基，碳末端有5个氨基酸残基，人CNP氨基酸残基环氮末端有5个氨基酸残基，碳末端没有氨基酸残基。ANP具有强烈的利钠、利尿和扩张动脉效应，但扩张静脉的效应很弱，CNP利钠、利尿及扩张动脉的活性很弱，但有强烈的扩张静脉作用。ANP、CNP结构及生物活性的差异表明，天然钠尿肽氨基酸环及其羧基端延伸的氨基酸残基序列可能对其生物活性有重要影响，将ANP氨基酸环羧基端的5个氨基酸残基加到CNP的相应部位，可能会得到一种具有新活性的钠尿肽，基于上述设想，Wei等于1993年首先设计并人工合成了具有新的生物活性的钠尿肽——血管钠肽(Vasonatrin pep tide，VNP)。

VNP是人CNP和ANP的嵌合体，它是在CNP的羧基端加上ANP羧基端的5个氨基酸残基形成的27肽，其二级结构也具二硫键形成的、17个氨基酸残基组成的环，分子量约为2867Da。其氨基酸序列为：Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr。具有新型生物活性的钠尿肽家族的新成员，已有的研究表明，VNP可能在慢性心力衰竭、高血压等疾病治疗中，较天然钠尿肽更具应用前景。但是，具有独特生物活性的VNP似乎并未引起人们的注意和重视，究其原因，一是化学合成只能保证氨基酸序列的一致性，而不能保证化合物与体内该化合物的药效学结构的相似性；其二，VNP二级结构中含有一17个氨基酸经过螺旋折叠、由二硫键连接形成的具药效学结构的氨基酸环，这对于其生物活性是必需的，化学合成的VNP虽然保证了氨基酸序列的一致性及二硫键的形成，但是由于化学合成环境与其在细胞内的折叠环境差别较大，从而很难保证正确的空间构象。本研究室经过分子动力学模拟和核磁共振分析后发现，与生物法获得的VNP相比，化学法合成的VNP主链拓扑结构存在很大的差异，其药物活性很难保证。

发明内容

本发明的目的就是为了突破目前血管钠肽(VNP)无法通过生物法来获得这一瓶颈，提供了一条通过基因工程法来制备血管钠肽的方法。

我们所采用的大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统，构建pGEX-4T-1质粒体系，表达出可溶性融合蛋白GST-VNP，经亲和层析，肠激酶酶切后可获得具有生物活性的血管钠肽。

本发明制备血管钠肽(VNP)的制备方法包括以下步骤：

(1)采用PCR技术将表达VNP的目的基因扩增，并纯化其产物；

(2)将纯化的PCR产物用EcoR I与Not I双酶切后定向插入经同样双酶切的pGEX-4T-1，获得重组质粒pGEX-4T-1-VNP；