[发明专利]一种通过基因工程重组技术制备血管钠肽(VNP)的方法无效
| 申请号： | 201010503402.5 | 申请日： | 2010-10-12 |
| 公开（公告）号： | CN101979576A | 公开（公告）日： | 2011-02-23 |
| 发明（设计）人： | 金坚;于军;李鹏;房聪;陈蕴;朱瑞宇;雷楗勇;姜曰水;朱妙章;陈健康 | 申请（专利权）人： | 江南大学;中国人民解放军第四军医大学 |
| 主分类号： | C12N15/16 | 分类号： | C12N15/16;C12N15/70;C07K14/575 |
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| 地址： | 214122 江苏省无锡*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 通过 基因工程 重组 技术 制备 血管 vnp 方法 | ||
1.血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于以下步骤：
采用PCR技术将表达VNP的目的基因扩增，并纯化其产物；
将纯化的PCR产物用EcoR I与Not I双酶切后定向插入经同样双酶切的pGEX-4T-1，获得重组质粒pGEX-4T-1-VNP；
将重组质粒pGEX-4T-1-VNP转化至大肠杆菌JM 109，经培养扩增，抽提纯化，测序分析，获得序列正确的重组质粒；
将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)菌，在30℃，0.5mM IPTG条件下表达重组蛋白；
将表达重组蛋白的活化菌接种到LB+AMP的培养基中，进行摇瓶实验，工程菌在发酵罐中发酵，至OD600nm0.8时进行IPTG诱导，6小时后放罐，离心得到菌体；
将离心后的菌体沉淀进行细胞破碎，破碎后离心收集上清液，进行GST亲和层析，洗脱得到融合蛋白GST-VNP；
将洗脱得到的融合蛋白GST-VNP通过Sephadex G25凝胶过滤脱盐，后采用肠激酶切割。切割条件：25℃，pH 7.6，12小时；
酶切后的产物再经GST亲和层析去掉GST标签，采用截留分子量为10000的超滤离心管对酶切后的样品进行纯化，去除少量的残余肠激酶，得到纯品VNP。
将纯品VNP在大鼠上采用离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价。
2.按权利要求1所述血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于：GST为亲和标签。
3.按权利要求1所述血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于：肠激酶酶切。
4.按权利要求1所述血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于：生物法获得的VNP较化学合成法具有更好的活性。
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