[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法

摘要

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体的检测方法，属于高新生物技术领域。以纯化的PRRSV重组NSP7蛋白作为包被抗原，通过一系列反应条件优化，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬(PRV)和猪2型圆环病毒阳性血清反应呈阴性，该方法特异性良好，具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPro试剂盒符合率分别为为93.3％和90％。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血清抗体的流行病学调查。

主权项

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7重组蛋白，是通过以下方法表达获得的：1.1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定设计两对引物，上游引物P1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆至pET‑28a载体，获得重组质粒pET‑28a‑NSP7；1.2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET‑28a‑NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗性培养皿，37℃过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37℃过夜振荡培养；第二天取1％的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度1.5mmol/L IPTG，诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Invitrogen公司Ni‑NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获NSP7重组蛋白。