[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7重组蛋白，是通过以下方法表达获得的：

1.1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定

设计两对引物，

上游引物P1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，

下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；

分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆至pET-28a载体，获得重组质粒pET-28a-NSP7；

1.2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET-28a-NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗性培养皿，37℃过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37℃过夜振荡培养；第二天取1％的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度1.5mmol/L IPTG，诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Invitrogen公司Ni-NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获NSP7重组蛋白。

2.用权利要求1所述NSP7蛋白建立的ELISA检测方法，包括：

1)用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2％牛血清白蛋白(BSA)封闭；

2)对待检血清用PBS进行1∶100稀释后，每孔加入稀释后的待检血清100微升，37℃作用1小时，PBST洗涤5次；

2)对酶标二抗用PBS进行1∶20000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗，37℃作用0.5小时，PBST洗涤5次；

3)加入底物TMB进行显色，37℃显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；

4)于450nm波长测定OD值，经统计学分析，得到OD450平均值X和标准差SD；

5)结果判定血清样品S/P≥X+3SD者判为阳性，S/P≤X+2SD者判为阴性，介于两者判为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。