[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达及检测方法

说明书

一.技术领域

本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体检测方法的建立属于生物技术高科技领域，专用于检测猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染情况和猪群中弱毒疫苗免疫后的抗体变化情况。

二、背景技术

国内外有关PRRS血清抗体的诊断方法有免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、血清中和试验(SN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶凝集实验(LAT)等^[8，9]。其中以ELISA因具有高度的敏感性和特异性，适用于大规模的检测，方便易行，操作过程及结果判定易于标准化应用等优点应用最为广泛。

到目前为止，PRRSV抗体检测的ELISA方法均以综合处理的结构蛋白或全病毒作为包被抗原。2009年，Elizabeth Brown等^[10]试验以非结构蛋白作为包被抗原检测I型和II型PRRSV抗体。研究发现NSP1、NSP2和NSP7具有较好的免疫原性，并研究了针对不同非结构蛋白的抗体产生规律，建立了以重组非结构蛋白NSP1、NSP2、NSP4、NSP7和NSP8作为包被抗原的间接ELISA检测方法。其中NSP7抗体在感染后14天可以检测到并持续至202天以后，与IDEXX抗体消长曲线类似。I型和II型NSP7抗体检测结果与IDEXX HerdChek PRRS 2XR ELISA的符合率分别为98.3％和99.3％。从而证明PRRSV非结构蛋白NSP7在抗体检测中也有较好的应用前景。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是用原核表达系统对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白进行表达，然后对表达蛋白进行纯化后建立ELISA检测方法。

技术方案本发明的实施方案如下：

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建立，其特征在于，用原核系统表达的NSP7蛋白具有表达量高，经亲和层析纯化后纯度高，完全可以作为包被抗原建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的ELISA方法。用表达蛋白建立的ELISA方法与其他ELISA方法进行比较，具有高度的敏感性和特异性，具有发展为商品化试剂盒的前景。

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA检测方法的建，是通过以下方法构建而成的：

1.1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定

设计两对引物，

上游引物P 1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，

下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；

分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆如pET-28a载体，获得重组质粒pET-28a-NSP7；

1.2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET-28a-NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗性培养皿，37℃过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37℃过夜振荡培养；第二天取1％的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0.4～0.6时，按终浓度1.5mmol/L IPTG和诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Invitrogen公司Ni-NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获蛋白。

用所述NSP7蛋白建立的ELISA方法，包括：

1)用权利要求1所述的重组NSP7蛋白包被ELISA板，2％BSA封闭；

2)对待检血清用PBS进行1∶100稀释后，每孔加入稀释后的待检血清100微升，37℃作用1小时，PBST洗涤5次；

2)对酶标二抗用PBS进行1∶20000稀释后，每孔加入100微升稀释的酶标二抗，37℃作用0.5小时，PBST洗涤5次；

3)加入底物TMB进行显色，37℃显色作用10分钟，然后用50微升2M的硫酸终止；

4)于450nm波长测定OD值，经统计学分析，得到OD450平均值X和标准差SD；

5)结果判定血清样品S/P≥X+3SD者判为阳性，S/P≤X+2SD者判为阴性，介于两者判为可疑，S待检样品的OD值，P阳性对照的OD值。

有益效果