[发明专利]一种MHV混合细胞培养多种病毒的培养方法

摘要

本发明属生物技术领域，涉及一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法，其通过T75细胞瓶制备MDCK、HEP-2、Vero单层细胞，经EDTA-胰酶消化，分别对所述细胞悬液计数后混合，制成细胞数为1.5×105/ml的细胞悬液，加入培养小瓶制成混合细胞培养瓶。本发明的混合细胞培养瓶可用于分离培养多种病毒，如甲型、乙型流感病毒；腺病毒；肠道病毒EV71。本发明方法通过三种细胞制成混合细胞瓶分离培养鉴定多种病毒病原，较现有技术分离培养效果好，克服传统分离培养病毒主要是用一种细胞系，通过推测可能感染的病毒来选取敏感细胞系的缺陷，既提高了病毒诊断的特异性和敏感性，又能比较快速的出结果。

主权项

一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法，其特征在于，其包括步骤：1)选择培养试剂细胞生长液为MEM母液加小牛血清，终浓度为10％，加庆大霉素，终浓度24ug/ml，7.5％NaHCO3调pH至7.0～7.2；病毒运输液为MEM母液加牛血清白蛋白，终浓度5ug/ml，加青、链霉素终浓度100ug/ml，加两性霉素终浓度0.5ug；病毒接种液为MEM母液加牛血清白蛋白终浓度5ug/ml，加青、链霉素终浓度50ug/ml，TPCK‑胰酶终浓度为2ug/ml；2)制备培养细胞：5～15代MDCK细胞、HEP‑2细胞和Vero细胞，分别在T75细胞瓶中长成单层细胞；3)制备MHV混合细胞瓶采用MDCK、Hep‑2、Vero细胞制备混合细胞培养瓶，分离培养呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；肠道病毒中的EV71病毒；4)标本接种：鼻咽拭标本处理：鼻咽标本4℃、2000r/min离心5min去除沉淀，0.22微米孔径滤膜过滤除菌或以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立阴性对照；粪便标本处理：粪便标本以1∶5比例悬浮于pH7.2PBS液，2000r/min离心5min去除粪便渣，0.22微米孔径滤膜过滤除菌再以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立阴性对照；5)培养物鉴定：接种标本24h以后，在倒置显微镜下观察培养细胞致细胞病变效应、荧光显微镜下观察特异蛋白单克隆免疫荧光染色、RT‑PCR、PCR扩增产物鉴定。