[发明专利]一种MHV混合细胞培养多种病毒的培养方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及病毒分离培养方法，具体涉及一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法。

背景技术

病毒性传染病传播速度快、范围广、社会危害影响大。因此，及时诊断感染的病原体对社会民心的稳定至关重要。研究报道，绝大多数的病毒性感染是由常见病毒病原引起，如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等引起呼吸道感染，肠道病毒属的EV71、CA16是引起儿童手足口病主要病毒病原。研究显示，病毒繁殖具有严格的嗜宿主细胞性，必须在合适的宿主细胞内生长，因此，病毒分离培养比较细菌的培养要困难。

目前，实验室分离培养病毒主要是采用一种细胞系，至于采用何种细胞系则根据疾病流行特征和症状，推测可能感染的病毒来选取敏感细胞系。通常，流感病毒分离培养主要采用MDCK细胞；腺病毒、呼吸道合胞病毒采用HEP-2细胞；EV71、CA16采用Vero细胞和MRC-5细胞。国外有文献报道采用二种或三种细胞分离培养主要呼吸道病毒。美国有机构专门出售二种或三种细胞的混合细胞。但目前为止，尚未见对于能分离培养呼吸道和肠道病毒的混合细胞的详细报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离培养多种病毒的培养方法，具体涉及一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法。本发明方法主要涉及呼吸道病毒中的甲、乙型流感病毒、腺病毒，肠道病毒中的EV71病毒分离培养，尤其涉及MDCK、HEP-2、Vero三种细胞分离培养常见呼吸道病毒、常见肠道病毒培养方法。

本方法通过T75细胞瓶制备MDCK、HEP-2、Vero单层细胞，单层细胞经EDTA-胰酶消化，分别对MDCK、Hep-2、Vero细胞悬液计数后混合，制成细胞数为1.5×10⁵/ml的细胞悬液，加入3ml培养小瓶制成混合细胞培养瓶，其中每株细胞的细胞数分别为5×10⁴/ml。

本发明的混合细胞培养瓶可用于分离培养多种病毒，包括甲型、乙型流感病毒；腺病毒；肠道病毒EV71，分离培养达到较好的效果。本发明通过三种细胞制成混合细胞瓶分离培养鉴定多种病毒病原，既提高了病毒诊断的特异性和敏感性，又能比较快速的出结果。

本发明方法选用的培养基为细胞培养常用培养基，培养条件在可控的温度和CO₂浓度下，对甲、乙型流感病毒、腺病毒，EV71病毒进行分离培养，分离培养结果满意。

具体而言，本发明的MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法，其特征在于，其包括步骤：

1)选择培养试剂

细胞生长液为MEM母液加小牛血清(终浓度为10％)，加庆大霉素(终浓度24ug/ml)，7.5％NaHCO₃调pH至7.0～7.2；病毒运输液为MEM母液加牛血清白蛋白(终浓度5ug/ml)加青、链霉素(终浓度100ug/ml)加两性霉素(终浓度0.5ug)；病毒接种液为MEM母液加牛血清白蛋白(终浓度5ug/ml)加青、链霉素(终浓度50ug/ml)TPCK-胰酶(终浓度为2ug/ml)。

2)制备培养细胞：

实验室保存的5～15代MDCK细胞、HEP-2细胞、Vero细胞，分别在T75细胞瓶中长成单层细胞。

本发明所采用的实验细胞均可通过市购的方式获得，并按常规方法实验室保存。

所述T75细胞培养瓶采用的是Corning公司产品，编号430720

3)制备MHV混合细胞瓶

采用MDCK、Hep-2、Vero细胞制备混合细胞培养瓶来分离培养呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；肠道病毒中的EV71病毒；

其中，MDCK、Hep-2、Vero三株细胞分别在T75细胞瓶中长成单层细胞后经EDTA-胰酶消化，分别对MDCK、Hep-2、Vero细胞悬液计数后混合，制成细胞数为1.5×10⁵/ml的细胞悬液，其中每株细胞的细胞数分别为5×10⁴/ml，将上述混合细胞悬液分装培养瓶中，3ml/瓶，置37℃、5％CO₂温箱中长成80％左右的细胞单层。

本发明中，优选EDTA-胰酶为0.25％EDTA-胰酶；

本发明中，优选细胞悬液计数采用白细胞计数板。

4)标本接种：

鼻咽拭标本处理：鼻咽标本4℃、2000r/min离心5min去除沉淀，0.22微米孔径滤膜过滤除菌或以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立阴性对照。