[发明专利]一种MHV混合细胞培养多种病毒的培养方法

权利要求书

1.一种MHV混合细胞分离培养多种病毒的培养方法，其特征在于，其包括步骤：

1)选择培养试剂

细胞生长液为MEM母液加小牛血清，终浓度为10％，加庆大霉素，终浓度24ug/ml，7.5％NaHCO₃调pH至7.0～7.2；

病毒运输液为MEM母液加牛血清白蛋白，终浓度5ug/ml，加青、链霉素终浓度100ug/ml，加两性霉素终浓度0.5ug；

病毒接种液为MEM母液加牛血清白蛋白终浓度5ug/ml，加青、链霉素终浓度50ug/ml，TPCK-胰酶终浓度为2ug/ml；

2)制备培养细胞：

5～15代MDCK细胞、HEP-2细胞和Vero细胞，分别在T75细胞瓶中长成单层细胞；

3)制备MHV混合细胞瓶

采用MDCK、Hep-2、Vero细胞制备混合细胞培养瓶，分离培养呼吸道病毒中的甲型、乙型流感病毒、腺病毒；肠道病毒中的EV71病毒；

4)标本接种：

鼻咽拭标本处理：鼻咽标本4℃、2000r/min离心5min去除沉淀，0.22微米孔径滤膜过滤除菌或以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立阴性对照；

粪便标本处理：粪便标本以1∶5比例悬浮于pH7.2PBS液，2000r/min离心5min去除粪便渣，0.22微米孔径滤膜过滤除菌再以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立阴性对照；

5)培养物鉴定：

接种标本24h以后，在倒置显微镜下观察培养细胞致细胞病变效应、荧光显微镜下观察特异蛋白单克隆免疫荧光染色、RT-PCR、PCR扩增产物鉴定。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，MDCK、Hep-2、Vero三株细胞分别在T75细胞瓶中长成单层细胞后经EDTA-胰酶消化，分别对MDCK、Hep-2、Vero细胞悬液计数后混合，制成细胞数为1.5×10⁵/ml的细胞悬液，其中每株细胞的细胞数分别为5×10⁴/ml，将上述混合细胞悬液分装培养瓶中，3ml/瓶，置37℃、5％CO₂温箱中长成80％左右的细胞单层。

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的EDTA-胰酶为0.25％EDTA-胰酶。

4.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的细胞悬液计数采用白细胞计数板。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，鼻咽拭标本采用模拟临床标本，具体制备如下述：

(1)采样管制备，取3.6ml病毒运输液加入10ml灭菌试管内；

(2)取-86℃保藏的甲型、乙型流感病毒液、腺病毒液、EV71病毒液各数株，每株病毒液吸取0.4ml加入上述采样管内1∶10稀释；

(3)每次随机选取志愿者，灭菌棉拭子在志愿者咽后壁和扁桃腺两侧轻轻擦拭，置入采样管内，做成模拟临床咽拭标本。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，采用甲型、乙型流感病毒单克隆免疫荧光抗体IMAGEN^TM influenza virus A and B(DAKO)；腺病毒单克隆免疫荧光抗体D3 ultra^TM DFA Respiratory virus ID kit(DIAGNOSTIC HYBRIDS)；泛肠道病毒混合免疫荧光抗体LIGHT DIAGNOSTICS^TM Pan-Enterovirus Reagent，MIILIPORE(chemicon)。

7.按权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的甲1型流感病毒RT-PCR扩增产物为431BP；乙型流感病毒扩增产物为390bp；腺病毒扩增产物为874bp。