[发明专利]一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法

摘要

本发明提出了一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法。表达步骤为：1)将DNA聚合酶基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体中，获得毕赤酵母重组表达质粒；2)将此重组表达质粒电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115，经MD平板和PCR鉴定筛选阳性克隆；3)挑取阳性克隆利用0.5％甲醇诱导表达。本发明能够用于表达DNA聚合酶基因。通过验证，与大肠杆菌表达系统相比，该方法能够明显提高DNA聚合酶的热稳定性等性能，且能够降低生产成本，缩短工艺流程，简化纯化步骤。

主权项

一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征在于：1)设计一对5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA碱基的引物，通过PCR的方法，将扩增下的产物，在dTTP的保护下经T4DNA聚合酶12℃处理20min后得到带有Cop I和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，与经过Cop I和Not I依次酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接，获得重组的毕赤酵母表达质粒；2)将毕赤酵母重组表达质粒用Sal I酶切线性化后，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，25℃-30℃培养2-4天，获得重组转化子；培养基MD组成为1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，4×10-5％Biotin，1.5％Agar；3)提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定获得已经正确插入DNA聚合酶基因的阳性克隆；4)接种鉴定验证正确的重组转化子于50mL BMGY培养基中，25℃-30℃150-250r/min培养40-50h，至OD600为6-10，于室温离心3000-6000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至25mL BMMY培养基中，25℃-30℃，150-250r/min培养，，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，表达时间24h-96h；BMGY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油；BMMY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH4)2SO4，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0；5)取表达上清液分析表达水平，其中表达时间为72h时表达水平为最佳。