[发明专利]一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是外源基因的诱导表达技术，特别是一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，是DNA聚合酶表达、生产的一种新思想、新途径、新方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一。此项技术因其操作简单、快速、灵敏度高和特异性强等优点广泛应用于分子生物学、医学等相关学科的领域中。

DNA聚合酶作为聚合酶链式反应中的重要工具之一，在PCR过程中起着至关重要的作用。直到1988年，Rand 11 K Saiki等(Saiki R K，Gelfand D H，Stoffel S，ScharfS，et al.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science，1988，239：487-491)从Thermus aquatics中分离纯化获得了Taq DNA聚合酶，并成功地将其应用于PCR技术，大大简化了PCR流程，使PCR过程实现了自动连续循环，应用领域逐渐拓宽。因此，如何进一步提高DNA聚合酶的产量及各项酶学性能，并利用它实现方便、快捷、高效的PCR，以满足不同科学研究及实际应用的需要，已经成为目前广大分子生物学学者关注的焦点。

由于大部分用于PCR的DNA聚合酶来源于古细菌，因此，人们倾向于用原核表达系统，而不是真核表达系统来表达DNA聚合酶。因此，目前国内外众多研究将编码极端酶的基因在异源普通宿主菌(如大肠杆菌)中进行表达，通过该方法表达的蛋白质大多数都能维持原来的热稳定性，它们通常在低温下折叠，并不被宿主的蛋白酶水解，因此可以通过热变性的方法除去宿主蛋白而进行纯化，酶产量亦有所提高，是相对经济的方法，从一定程度上促进了PCR技术的广泛应用，并节约了PCR成本，但是在这个过程中仍然面临着纯化困难，成本较高等各种各样的问题(Francois Baneyx Recombinant protein expression in Escherichia coliCurrent Opinion in BiotechnologyVolume 10，Issue 5，1October 1999，Pages 411-421)。例如，如果培养温度过高，生长速度过快或生长过度，外源基因表达的目的蛋白大多数容易形成包涵体，这就需要将其转化为可溶性蛋白，这个步骤不但繁琐而且会降低酶活性。人们不断尝试对接种量、培养温度、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度等因素做进一步的优化，以期待提高目的蛋白的表达量和比活性，甚至是某些酶学性能。

发明内容

本发明的目的是提出一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，提供了除大肠杆菌表达DNA聚合酶以外的新方法。

具体做法如下：

1)设计一对5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA碱基的引物，通过PCR的方法，将扩增下的产物，在dTTP的保护下经T4DNA聚合酶12℃处理20min后得到带有Cop I和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，与经过Cop I和Not I依次酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接，获得重组的毕赤酵母表达质粒；

2)将毕赤酵母重组表达质粒用Sal I酶切线性化后，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，涂布组氨酸缺陷培养基MD(1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH₄)₂SO₄，4×10^-5Biotin，1.5％Agar)平板，25℃-30℃培养2-4天，获得重组转化子；

3)提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定已经正确插入DNA聚合酶基因的阳性克隆；