[发明专利]一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法

权利要求书

1.一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征在于：

1)设计一对5’端引入GTCA，3’端引入GGCCA碱基的引物，通过PCR的方法，将扩增下的产物，在dTTP的保护下经T4DNA聚合酶12℃处理20min后得到带有Cop I和NotI粘性末端的DNA聚合酶基因，与经过Cop I和Not I依次酶切的毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A连接，获得重组的毕赤酵母表达质粒；

2)将毕赤酵母重组表达质粒用Sal I酶切线性化后，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，涂布组氨酸缺陷培养基MD平板，25℃-30℃培养2-4天，获得重组转化子；培养基MD组成为1.34％YNB，2％葡萄糖，1％(NH₄)₂SO₄，4×10^-5％Biotin，1.5％Agar；

3)提取转化子基因组，通过PCR的方法鉴定获得已经正确插入DNA聚合酶基因的阳性克隆；

4)接种鉴定验证正确的重组转化子于50mL BMGY培养基中，25℃-30℃150-250r/min培养40-50h，至OD₆₀₀为6-10，于室温离心3000-6000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至25mL BMMY培养基中，25℃-30℃，150-250r/min培养，，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，表达时间24h-96h；

BMGY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH₄)₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油；

BMMY培养基为2％Tryptone，1％Yeast extract，0.34％YNB，1％(NH₄)₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0；

5)取表达上清液分析表达水平，其中表达时间为72h时表达水平为最佳。

2.根据权利1要求所述的一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征是表达DNA聚合酶基因，包括DNA依赖性DNA聚合酶基因和RNA依赖性DNA聚合酶基因。

3.根据权利1要求所述的一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，其特征在于用于实现DNA聚合酶基因表达的载体是所有毕赤酵母表达载体，包括胞内表达载体和胞外表达载体。