[发明专利]白细胞介素-2基因整合表达载体的构建及定位方法

摘要

人白细胞介素-2基因整合表达载体的构建，以人静脉血为试验材料，提取总RNA，反转录成cDNA，针对人白介素2基因的编码区，设计一对含酶切位点的特异性引物，分别引入白介素-2基因的编码区的ApaI酶切位点和SalI酶切位点，PCR扩增并克隆到pMDTM19-TVector载体中；以pBC1质粒为模板，扩增β-酪蛋白5′同源短臂和β-酪蛋白3′同源长臂，以pIRES质粒为模板，扩增新霉素抗性筛选标记基因序列；以pBluskm为载体骨架，分别与5′同源短臂、3′同源长臂和新霉素抗性筛选标记基因序列相连，构建重组载体5′-3′-E-neor，双酶切含IL-2基因的pMDTM19-T Vector载体，凝胶回收目的片段并与5′-3′-E-neor相连，构建IL-2基因整合表达载体；利用脂质体将构建的IL-2基因整合表达载体转染胎儿成纤维细胞，定位在β-酪蛋白基因序列中。

主权项

白细胞介素 2基因整合表达载体的构建方法，其特征在于，包括：1)以人静脉血为试验材料，从血液中提取总RNA，反转录成cDNA，针对人白介素 2基因的编码区，设计一对含酶切位点的特异性引物P1，分别引入白介素 2基因的编码区的ApaI酶切位点和SalI酶切位点，PCR扩增得到目的片段，并克隆到pMDTM19 T Vector载体中；所述的特异性引物P1如下：F：GGGCCCGCGATGTACAGGATGCAACTCCR：ACGCGTCGACGCGTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT2)以pBC1质粒为模板，设计扩增β 酪蛋白5′同源短臂的含酶切位点的特异性引物P2，以及扩增β 酪蛋白3′同源长臂的且含酶切位点的特异性引物P3，PCR扩增β 酪蛋白5′同源短臂的调控序列和β 酪蛋白3′同源长臂；所述的引物P2如下：5′同源臂F：GGGGTACCTCAGGTCTAAGGTATCATCG5′同源臂R：GGGCCCGAATAGGGAAGGGTCC所述的引物P3如下：3′同源臂F：TCCCCGCGGTGGACATTTGTTCTCTAT3′同源臂R：CGAGCTCTGTATTGCAGGTGAAT3)以pIRES质粒为模板，设计扩增新霉素抗性基因表达盒的含酶切位点的特异性引物P4，PCR扩增新霉素抗性筛选标记基因序列；以pBluskm为载体骨架，分别与5′同源短臂的调控序列、3′同源长臂和新霉素抗性筛选标记基因序列相连，构建重组载体5′ 3′ E neor，双酶切含IL 2基因的pMDTM19 T Vector载体，凝胶回收目的片段并与5′ 3′ E neor相连，得到IL 2基因整合表达载体5′ 3′ E neor IL 2；所述的引物P4如下：Neor F：ACGCGTCGACGGTATTTTCTCCTTACGCNeor R：CCATCGATATCGCTATCGATTCAC所述的PCR扩增的条件是：50μL反应体系，包括2.5U Taq DNA聚合酶，8μL的2.5mM dNTPmix，1.5μL的cDNA模板，5μL的10×LAPCR Buffer(Mg2+)10pmol/μL的特异性引物的上、下游引物各1μL和灭菌超纯水33μL；PCR反应程序如下：(1)利用引物P1扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；(2)利用引物P2扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，62℃退火60s，72℃延伸150s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。(3)利用引物P3扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸150s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。(4)利用引物P4的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。