[发明专利]白细胞介素-2基因整合表达载体的构建及定位方法

权利要求书

1.白细胞介素-2基因整合表达载体的构建方法，其特征在于，包括：

1)以人静脉血为试验材料，从血液中提取总RNA，反转录成cDNA，针对人白介素-2基因的编码区，设计一对含酶切位点的特异性引物P1，分别引入白介素-2基因的编码区的ApaI酶切位点和SalI酶切位点，PCR扩增得到目的片段，并克隆到pMD^TM19-T Vector载体中；所述的特异性引物P1如下：

F：GGGCCCGCGATGTACAGGATGCAACTCC

R：ACGCGTCGACGCGTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT

2)以pBC1质粒为模板，设计扩增β-酪蛋白5′同源短臂的含酶切位点的特异性引物P2，以及扩增β-酪蛋白3′同源长臂的且含酶切位点的特异性引物P3，PCR扩增β-酪蛋白5′同源短臂的调控序列和β-酪蛋白3′同源长臂；

所述的引物P2如下：

5′同源臂F：GGGGTACCTCAGGTCTAAGGTATCATCG

5′同源臂R：GGGCCCGAATAGGGAAGGGTCC

所述的引物P3如下：

3′同源臂F：TCCCCGCGGTGGACATTTGTTCTCTAT

3′同源臂R：CGAGCTCTGTATTGCAGGTGAAT

3)以pIRES质粒为模板，设计扩增新霉素抗性基因表达盒的含酶切位点的特异性引物P4，PCR扩增新霉素抗性筛选标记基因序列；以pBluskm为载体骨架，分别与5′同源短臂的调控序列、3′同源长臂和新霉素抗性筛选标记基因序列相连，构建重组载体5′-3′-E-neo^r，双酶切含IL-2基因的pMD^TM19-T Vector载体，凝胶回收目的片段并与5′-3′-E-neo^r相连，得到IL-2基因整合表达载体5′-3′-E-neor-IL-2；

所述的引物P4如下：

Neo^r F：ACGCGTCGACGGTATTTTCTCCTTACGC

Neo^r R：CCATCGATATCGCTATCGATTCAC

所述的PCR扩增的条件是：50μL反应体系，包括2.5U Taq DNA聚合酶，8μL的2.5mM dNTPmix，1.5μL的cDNA模板，5μL的10×LAPCR Buffer(Mg²⁺)10pmol/μL的特异性引物的上、下游引物各1μL和灭菌超纯水33μL；

PCR反应程序如下：

(1)利用引物P1扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

(2)利用引物P2扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，62℃退火60s，72℃延伸150s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

(3)利用引物P3扩增的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，58℃退火60s，72℃延伸150s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

(4)利用引物P4的PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性60s，52℃退火30s，72℃延伸90s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

2.权利要求1所述的白细胞介素-2基因整合表达载体的定位方法，其特征在于，利用脂质体将重组质粒5′-3′-E-neor-IL-2和pIRES2-ZsGreen1质粒转染胎儿成纤维细胞，继续培养24h后取出转染了pIRES2-ZsGreen1质粒的细胞在荧光显微镜下观察，随机计数显微镜下10个视野的发出绿色荧光的细胞数和总细胞数，其转染效率15.66％；G418筛选阳性克隆，待细胞大量增值后，提取DNA，利用特异性引物P1，PCR扩增出白细胞介素-2基因；

所述的特异性引物P1如下：

F：GGGCCCGCGATGTACAGGATGCAACTCC

R：ACGCGTCGACGCGTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT

PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。