[发明专利]利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法

摘要

一种利用在昆虫表达系统中获得白藜芦醇芪合酶的方法，在采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的同时，将白藜芦醇芪合酶基因5’端的30个碱基替换为家蚕杆状病毒多角体基因5’端的30个碱基的方式以增强白藜芦醇芪合酶基因在昆虫表达系统中高效表达。白藜芦醇芪合酶表达产物经纯化后被用于白藜芦醇的生物转化。本发明技术方案既克服了化学合成技术上所存在的问题，还克服了原核表达系统所得产物活性低的问题，操作过程简单，能充分利用果皮废弃物，符合低碳经济理念，能结合产业化生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。

主权项

一种利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，包括：1)通过RT‑PCR从葡萄组织中获得白藜芦醇芪合酶基因，并在其5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上Sal I酶切位点，获得重组基因；2)把步骤1)获得的重组基因经BamH I和Sal I双酶切后与pFastBac HTA质粒载体连接并获得重组pFastBac HTA‑llcjy质粒；3)把步骤2)得到的重组质粒转化DH 10Bac大肠杆菌感受态细胞；4)经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组Bacmid DNA；5)用脂质体介导法转染昆虫细胞，获得重组病毒，保藏号CGMCC3673；6)重组病毒的鉴定及大量扩增；7)重组病毒接种家蚕蛹，28℃±2℃反应5到7天，即获得大量表达白藜芦醇芪合酶的工程蚕蛹；8)蚕蛹用0.85wt％生理盐水按重量比1∶1混和后匀浆，然后多次离心后用G150分子筛纯化并脱盐后获得重组白藜芦醇芪合酶。