[发明专利]利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种从昆虫表达系统表达的白藜芦醇芪合酶制备白藜芦醇的方法，即利用昆虫系统表达的白藜芦醇合成的关键酶(芪合酶)，以西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮等的提取液为底物在体外合成白藜芦醇的方法。

背景技术

白藜芦醇药用价值的研究越来越受到国内外学者的青睐，Jang等在Science杂志上对白藜芦醇在癌症的始发、促进及发展阶段表现出的抑制作用进行了系列报道，从而使白藜芦醇成为癌症化学预防和化学治疗领域的一个研究热点。

体外试验证实白藜芦醇可以抑制血小板功能和内皮细胞TF的表达，从而减少血栓形成。体外试验还证实白藜芦醇由于抑制了类花生酸的合成和血小板钙通道，从而抑制了由血栓素、ADP和胶原诱导的血小板聚集。在诱发心血管疾患的内皮源性介质中，21个氨基酸的内皮素21(ET21)是一个重要的先行分子。白藜芦醇已被发现可作为ET21的拮抗剂，可以拮抗ET21对大鼠的杀伤效应，并能够抑制由ET21所致的血压升高。在高胆固醇血症的兔子模型中，白藜芦醇可减少血浆ET21水平，并显著升高NO水平。这些研究结果显示白藜芦醇可改善内皮细胞功能，也是白藜芦醇发挥非酒精依赖性的心血管保护效应的机制之一。

Orgogozo等调查后发现，经常饮用红葡萄酒的老年人罹患老年痴呆病的几率显著下降，推测红酒具有神经保护作用。之后，大量实验证实白藜芦醇是红葡萄酒中发挥神经保护作用的主要物质，研究发现，白藜芦醇可以标识激酶和神经细胞，通过葡萄酒摄入白藜芦醇，对于老年人的退化病，如帕金森症、痴呆症、风湿性疾病都有较好的预防和治疗作用。

多羟基芪类物质大都具有抗氧化、抗自由基作用。研究证明，白藜芦醇具有抗氧化、抗自由基及影响花生四烯酸代谢的药理作用。这也是其具有多重生物学效应的重要机制之一。有研究表明，白藜芦醇能显著抑制肝微粒体、脑线粒体及突触体氧化损伤过程中DNA的生成，对病毒性肝炎、帕金森病、阿尔茨海默病等疾病有很好的防治作用。

白藜芦醇及白藜芦醇苷对脂质过氧化有很强的抑制作用，能降低血清和肝脏的脂质，减少脂质过氧化物在体内的堆积，保护肝脏不受损害。另外，白藜芦醇还能通过选择性下调细胞周期蛋白cyclinD1的表达，使星状细胞静止在G1期，从而有利于抑制肝纤维化的形成。

综上所述，白藜芦醇具有多方面有益于人类健康的生物药理活性，使其广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。其在肿瘤、心脑血管疾病、痴呆、病毒性肝炎、炎症疾病等方面的治疗及预防作用也越来越被人们认识，其临床应用前景广阔，有望成为一种可防治多种疾病的新型药物。然而，白藜芦醇市场售价极为昂贵，而且不宜为大多数人所利用。

白藜芦醇的获得可以通过化学合成法得到，然而现有的化学合成方法，如Wittig法和Wittig-Horner法、Perkin反应法、Heck反应法等都存在着产物的顺反异构选择性不高，收率低，生成的副产难以除去，合成路线步骤繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表达载体产生的目的蛋白生物活性极低或无生物活性，植物表达系统一般产量低，周期长，难以大规模投入生产，更难以满足市场需要；而酵母和动物表达系统生产药物成本极高，产量极低，也存在相同的问题。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是近年来一种发展迅速的高效、便捷的新型真核表达系统。通过位点特异的转座可方便地将外源基因插入到杆状病毒穿梭载体上，然后提取含有外源基因的重组Bacmid，将其转染入昆虫细胞即可获得含有外源基因的重组病毒用于表达目的蛋白。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统已在各领域得到广泛运用，受到广泛关注。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统经过多年的发展，已分化出面向苜蓿银纹夜蛾杆状态病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)、家蚕杆状病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)和棉铃虫杆状病毒(Helicoverpa armigera nuclearpolyhedrosis virus，HaNPV)的3个子系统。AcMNPV的Bac-to-Bac系统发展最早，研究也最深入，对其他两个系统的发展影响很大。近年来，Invitrogen公司应用Bac-to-Bac策略已开发出面向AcMNPV的表达系统。该系统中，Bacmid包含有mini2F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn7的靶位点(mini-attTn7)以及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。