[发明专利]利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法

权利要求书

1.一种利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，包括：

1)通过RT-PCR从葡萄组织中获得白藜芦醇芪合酶基因，并在其5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上Sal I酶切位点，获得重组基因；

2)把步骤1)获得的重组基因经BamH I和Sal I双酶切后与pFastBac HTA质粒载体连接并获得重组pFastBac HTA-llcjy质粒；

3)把步骤2)得到的重组质粒转化DH 10Bac大肠杆菌感受态细胞；

4)经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组Bacmid DNA；

5)用脂质体介导法转染昆虫细胞，获得重组病毒，保藏号CGMCC3673；

6)重组病毒的鉴定及大量扩增；

7)重组病毒接种家蚕蛹，28℃±2℃反应5到7天，即获得大量表达白藜芦醇芪合酶的工程蚕蛹；

8)蚕蛹用0.85wt％生理盐水按重量比1∶1混和后匀浆，然后多次离心后用G150分子筛纯化并脱盐后获得重组白藜芦醇芪合酶。

2.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述RT-PCR的上游引物为5′-GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTCCGGC，下游引物为5′-GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。

3.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述蓝白斑筛选选择含卡那霉素、庆大霉素和四环素的固体培养基。

4.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述的重组白藜芦醇芪合酶如SEQ ID No2。

5.一种白藜芦醇的制备方法，包括：

1)在30℃下，把按权利要求1所述利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法制得的白藜芦醇芪合酶与西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反应6～8小时，获得反应混合物；

2)反应混合物用大孔树脂纯化。

6.如权利要求4所述的白藜芦醇的制备方法，其特征是所述大孔树脂纯化的方法为使用中极性的粒径在0.30～1.25mm的大孔树脂DM-130进行富集，在常温条件下，用质量分数为60％的乙醇作解吸剂，以2.0mL/min的流速对已吸附了样品的白藜芦醇进行洗脱，收集洗脱液，获得的洗脱液经真空旋转蒸发浓缩，去除有机溶剂，并冷冻干燥，得到白藜芦醇粗制品。