[发明专利]基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法

摘要

本发明涉及一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括：巯基丙酸MPA包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备；HBV DNA检测探针的设计及合成；QDs-DNA探针交联物的制备；HBV DNA临床样本的制备；使用酶标仪对互补的及单碱基突变的HBV靶DNA的高通量检测。该方法操作简单，不需要对杂交体系中未联接的DNA进行分离纯化；由于Cy5在所选的激发光(485nm)下不会直接产生荧光信号，因此背景干扰小，信号强；该方法还具有特异、快速、高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，可应用于临床医学中HBV DNA及单碱基突变的高通量和多靶标的检测。

主权项

一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括：(一)检测探针的制备及HBV DNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0.5mL荧光发射峰为575～615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/壳结构QDs的甲苯溶液，加入2～4mL氯仿，再逐滴加入2～4mL巯基丙酸MPA溶液，室温搅拌30～60分钟，加入5～8mL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli‑Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs；(2)HBV DNA扩增引物及检测探针的设计合成PCR扩增引物：PCR上游引物：5’‑ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC‑3’；PCR下游引物：5’‑CAGAGCAGAGGCGGTGTCG‑3’；检测探针：‑NH2修饰的单链DNA探针：5’‑TGG ATG ATG TGG TAT(T)10(CH2)3‑(NH2)‑3’；‑Cy5标记的信号DNA探针‑1：5’‑Cy5‑TGG CTT TCA GTT ATA‑3’；‑Cy5标记的信号DNA探针‑2：5’‑Cy5‑TGG CTT TCA GTT ATG‑3’；(3)QDs‑DNA探针交联物的制备将0.5g/L的1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)‑碳化二亚胺EDC、0.5g/L的N‑羟基琥珀酰亚胺NHS和0.05μM的MPA包裹的QDs按体积比为1～2∶1～2∶2～6的比例混合，活化0.5～2小时，然后加入上述‑NH2功能化修饰过的单链DNA探针，于37℃孵化0.5～2小时，制备得到QDs‑DNA探针交联物；(4)HBV DNA临床样本的制备采用裂解法抽提阳性血清样品中HBV基因组DNA，然后对HBV DNA进行PCR扩增，制得HBV DNA临床待测样本；(二)使用酶标仪对互补靶HBV DNA及单碱基突变的检测(1)互补靶HBV DNA及单碱基突变的检测将10μL的HBV DNA的PCR待测样本加入到115μL(20mM)的Taq联接缓冲液中，在PCR仪上经95℃变性5分钟，使其解为单链；随后将该混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴5分钟；然后向该混合液中加入70μL上述(一)/(3)中的QDs‑DNA探针、10μL的Cy5标记的信号探针‑1(10μM)、5μL(1个单位)的Taq DNA联接酶；将该混合液共210μL于42℃下反应15～30分钟，在联接反应完成后，将该反应混合液于Eppendorf PCR仪上在85℃下加热变性5分钟，使双链解离变为单链；变性后，立即将反应混合液置于冰水中冰浴5分钟；冰浴后将反应混合液迅速转移至96孔板酶标仪中，在Wallac 1420型酶标仪上采用485nm光激发，检测杂交反应液670nm处的荧光发射强度，从而实现对完全互补的或单碱基突变的HBV DNA临床样本的检测；(2)互补靶HBV DNA及单碱基突变检测的结果判断①基于QDs‑Cy5荧光共振能量转移的HBV DNA野生型的定量检测将上述(二)/(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若上述(1)中670nm处的荧光发射强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBV DNA未发生突变，即为野生型，这时可将该样本于670nm处的荧光发射强度与标准曲线进行对比，可以确定样本中HBV DNA的浓度，从而实现了对野生型HBV DNA的定量检测；②基于QDs‑Cy5荧光共振能量转移的HBV DNA单碱基突变的检测将上述(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度与空白噪声的荧光强度相当，则判断该样本中的HBV DNA发生了单碱基突变；③HBV单碱基突变样本的突变类型的判断替换步骤(二)/(1)中的待测样本为上述②中的HBV DNA的单碱基突变样本，并将该步骤中的Cy5标记的信号探针‑1替换为Cy5标记的信号探针‑2，其他方法相同进行检测；将突变样本于670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBVDNA发生了YVDD突变，反之则为其他突变。