[发明专利]基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法

说明书

技术领域

本发明属靶DNA或单碱基突变的检测领域，特别是涉及一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法。 

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的疾病，乙肝病毒的感染是一个全球性的健康问题。全世界将近有3.5亿HBV慢性携带者，我国有1.2亿HBV病毒携带者，并呈上升趋势。HBV的感染可以引起多种疾病，比如：慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。在HBV的治疗方面，通过抗HBV药物来抑制病毒复制是目前治疗慢性乙型肝炎(CHB)最重要和有效的方法。诸如拉米呋啶和阿德福韦等药物已广泛用于抗HBV的治疗。但药物长期应用后，病毒产生基因突变，进而引发的变异和耐药性问题已成为临床中的棘手问题。因此，定量检测HBV DNA及碱基突变在HBV基础研究和临床实践中具有重要意义。目前最常见的检测HBV感染及单碱基突变的方法包括：凝胶电泳聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、分支DNA信号扩增法(branched DNA signal ampli-fication assay)、等位特异的DNA杂交方法(allele-specific DNA hybridization)、连接或引物延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信标的荧光共振能量转移(molecular-beacon-based fluorescence resonance energy transfer)，电化学检测(electroche mical detect-ing)等。但这些方法普遍存在一些缺陷，或者操作过程复杂，或者灵敏度不高，或者比较费时，缺乏多靶标高通量检测的能力。因此建立简单、特异、快速和高通量的靶DNA及单碱基突变检测的方法是解决临床应用的关键问题。 

量子点(quantum dots，QDs)，是一种新型的荧光探针。自从第一批报道使用修饰的CdSe/ZnS核/壳结构QDs作为荧光标记物标定生物样品以来，QDs近年来已在众多的生物分析和生理过程研究中引起广泛的关注和应用。QDs具有许多独特的光物理性质，如宽广的吸收光谱和狭窄的发射光谱，这使得它们可以作为良好的能量供体应用于基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)的传感器中。这是因为这些荧光特性允许我们能够在QDs宽广的吸收光谱中选择某个激发波长进行激发，从而避免对染料受体(如Cy5)的直接激发；并可以选择适当的滤光片对供体和受体发射的荧光进行有效的分离。迄今为止，研究者们已构建了多种以FRET为基础的QDs纳米传感器。这些传感器已被成功用于多种分析物的检测，包括营养物质、爆炸物、蛋白质、酶以及pH值的变化等。与此同时，也有研究集中在基于FRET的QDs-DNA纳米传感器应用于寡核苷酸 (DNA)的识别，通过寡核苷酸杂交后引起的FRET荧光发射信号的变化从而达到对寡核苷酸(DNA)的识别和检测。但是许多QDs-DNA传感器的制备过程复杂，代价高，而且制备得到的探针不能够长期保存。绝大多数情况下，构建的QDs-DNA FRET传感器是在常规的荧光仪上实现对靶DNA的检测的，但是利用普通荧光仪进行检测的方法通常都比较繁琐和费时。也有一些研究者通过将QDs植入到纳米管上或者结合单分子荧光检测技术，可以获得检测灵敏度很高的DNA传感器，然而这些方法中传感器制备过程的复杂性，以及需要精贵复杂的仪器，都使得这些方法的应用受到了限制。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于量子点荧光共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，以解决现有技术中的缺陷。 

本发明的一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括： 

(一)检测探针的制备及HBV DNA临床样本的制备 

(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备 

取0.5mL荧光发射峰为575～615nm的三辛基氧化磷(TOPO)包裹的CdSe/ZnS核/壳结构QDs的甲苯溶液，加入2～4mL氯仿，再逐滴加入2～4mL巯基丙酸(MPA)溶液，室温搅拌30～60分钟，加入5～8mL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnSQDs； 

(2)HBV DNA检测探针的设计及合成