[发明专利]基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法

权利要求书

1.一种基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法，包括：

(一)检测探针的制备及HBV DNA临床样本的制备

(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备

取0.5mL荧光发射峰为575～615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/壳结构QDs的甲苯溶液，加入2～4mL氯仿，再逐滴加入2～4mL巯基丙酸MPA溶液，室温搅拌30～60分钟，加入5～8mL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli-Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs；

(2)HBV DNA扩增引物及检测探针的设计合成

PCR扩增引物：

PCR上游引物：5’-ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC-3’；

PCR下游引物：5’-CAGAGCAGAGGCGGTGTCG-3’；

检测探针：

-NH₂修饰的单链DNA探针：5’-TGG ATG ATG TGG TAT(T)₁₀(CH₂)₃-(NH₂)-3’；

-Cy5标记的信号DNA探针-1：5’-Cy5-TGG CTT TCA GTT ATA-3’；

-Cy5标记的信号DNA探针-2：5’-Cy5-TGG CTT TCA GTT ATG-3’；

(3)QDs-DNA探针交联物的制备

将0.5g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC、0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和0.05μM的MPA包裹的QDs按体积比为1～2∶1～2∶2～6的比例混合，活化0.5～2小时，然后加入上述-NH₂功能化修饰过的单链DNA探针，于37℃孵化0.5～2小时，制备得到QDs-DNA探针交联物；

(4)HBV DNA临床样本的制备

采用裂解法抽提阳性血清样品中HBV基因组DNA，然后对HBV DNA进行PCR扩增，制得HBV DNA临床待测样本；

(二)使用酶标仪对互补靶HBV DNA及单碱基突变的检测

(1)互补靶HBV DNA及单碱基突变的检测

将10μL的HBV DNA的PCR待测样本加入到115μL(20mM)的Taq联接缓冲液中，在PCR仪上经95℃变性5分钟，使其解为单链；随后将该混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴5分钟；然后向该混合液中加入70μL上述(一)/(3)中的QDs-DNA探针、10μL的Cy5标记的信号探针-1(10μM)、5μL(1个单位)的Taq DNA联接酶；

将该混合液共210μL于42℃下反应15～30分钟，在联接反应完成后，将该反应混合液于Eppendorf PCR仪上在85℃下加热变性5分钟，使双链解离变为单链；变性后，立即将反应混合液置于冰水中冰浴5分钟；

冰浴后将反应混合液迅速转移至96孔板酶标仪中，在Wallac 1420型酶标仪上采用485nm光激发，检测杂交反应液670nm处的荧光发射强度，从而实现对完全互补的或单碱基突变的HBV DNA临床样本的检测；

(2)互补靶HBV DNA及单碱基突变检测的结果判断

①基于QDs-Cy5荧光共振能量转移的HBV DNA野生型的定量检测

将上述(二)/(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若上述(1)中670nm处的荧光发射强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBV DNA未发生突变，即为野生型，这时可将该样本于670nm处的荧光发射强度与标准曲线进行对比，可以确定样本中HBV DNA的浓度，从而实现了对野生型HBV DNA的定量检测；

②基于QDs-Cy5荧光共振能量转移的HBV DNA单碱基突变的检测

将上述(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度与空白噪声的荧光强度相当，则判断该样本中的HBV DNA发生了单碱基突变；

③HBV单碱基突变样本的突变类型的判断

替换步骤(二)/(1)中的待测样本为上述②中的HBV DNA的单碱基突变样本，并将该步骤中的Cy5标记的信号探针-1替换为Cy5标记的信号探针-2，其他方法相同进行检测；

将突变样本于670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBV

DNA发生了YVDD突变，反之则为其他突变。