[发明专利]同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法

摘要

本发明涉及一种多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目的方法。采用实时荧光PCR技术比较CT值的相对定量法，即ΔCT值法，对人21及18号染色体上的APP及TYMS基因部分片段在同一管中相互作为内参照同时扩增，计算两扩增产物的ΔCT值，对其相对模板量做出判断，通过ΔCT值来确定人21及18号染色体的数目。其优点：自动化闭管操作，简单、快速、成本低、无污染、通量大；检测特异性高，灵敏度高，准确可靠，并可同时对人21及18号染色体的数目做出检测。

主权项

一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.样品DNA提取：按常规苯酚‑氯仿法提取样本的DNA，检测DNA浓度及纯度；B.引物设计和合成：选择21号染色体21q21.3上的淀粉样前蛋白基因部分片段和18号染色体18p11.32上的胸苷酸合成酶基因部分片段，设计相应引物，使得两基因部分片段在同一管中相互作为内参照同时扩增；并设计相应的Taqman探针，探针3′端标记非荧光性的淬灭基因Eclipse，5′端标记FAM或HEX荧光基团；其中，针对21号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.3；针对18号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.4，下游引物序列为SEQ IDNO.5，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.6；C.多重实时荧光PCR扩增反应：采用25ul反应体系，包含：模板DNA 2ul(60ng)，两对引物各300nmol/L，相应TaqMan荧光探针各200nmol/L，1×TaqMan通用PCR混合试剂12.5ul；该混合试剂中含有热启动DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、荧光染料ROX；每个DNA标本进行3个平行管的扩增；热循环条件为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后95℃15秒，60℃1分钟，循环40次；D.相对定量分析方法：采用ABI7500型PCR仪随机附带软件进行荧光相对定量分析；分析参数设定：阈值线设在对数期并超过无规则噪音线的最高处，不同批次采用同一阈值分析，将阈值设定为0.2；基线范围起点为第3个循环，终点为第19个循环；仪器附带软件根据设定参数自动计算出CT值，APP基因部分片段的扩增产物与TYMS基因部分片段的扩增产物CT值之差为相对定量指标ΔCT值，取3个平行管ΔCT值的平均值；通过ΔCT值来确定21及18号染色体的数目。