[发明专利]同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法无效

专利信息
申请号: 200910194364.7 申请日: 2009-12-03
公开(公告)号: CN102086469A 公开(公告)日: 2011-06-08
发明(设计)人: 孙筱放;眭建忠 申请(专利权)人: 广州医学院第三附属医院
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;G01N21/64
代理公司: 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人: 刘宇峰
地址: 510150 广*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 同时 21 18 染色体 数目 进行 检测 方法
【说明书】:

技术领域

本发明属于分子生物学领域,涉及检测染色体数目的方法,尤其涉及应用多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目的方法。

背景技术

21及18三体综合征是胎儿出生缺陷最常见的两种染色体病,发病率分别为1/600~1/800和1/6000,表现为21或18号染色体数目的异常,即患者在正常两条的基础上多了一条(或多了部分21/18号易位染色体)。此两种病患者有严重的智力发育迟缓和多发畸形,患儿早期死亡率高,给家庭和社会带来沉重负担。此两种疾病尚无有效治疗,主要通过产前诊断来避免缺陷儿的出生。目前主要依靠传统的细胞遗传学方法来检测,该方法所需培养时间长,出结果慢,费时费力,增加了患者等待结果的焦虑。荧光原位杂交(FISH)技术费用昂贵、操作技术要求高、存在一定的漏诊率等。近年,分子生物技术的发展突飞猛进,如短串联重复数目多态性(STR)分析、多重连接探针扩增(MLPA)及比较基因组杂交(Array-based CGH)技术都有应用于产前诊断遗传疾病的报道,但这些技术由于费用、设备等局限性,难以普及应用。因此,临床急需准确、快速、高通量、无污染、能大规模应用的分子检测技术。

最近发展而来的实时荧光PCR(Real-time PCR)技术,是在PCR反应体系中加入引物和相对应的荧光标记的探针.它融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量等优点,直接监测PCR过程中荧光信号的累积量。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,并由此来推断模板分子最初的拷贝数。首先需设定一定荧光信号的阈值,一般阈值设在扩增对数期并超过无规则噪音线的最高处。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号,它可以定义样本的阈值循环数(CT)。CT的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。21、18三体综合征的21、18号染色体原始拷贝数是其他正常染色体数目的1.5倍,因此21、18号染色体基因上的扩增产物量更早到达阈值,Ct值更小,利用原始拷贝数量上相对定量法,即ΔCT值法,便可对三体做出检测。

Real-time PCR技术已经成为准确检测模板拷贝数、体液游离DNA及肿瘤研究中基因重复或缺失的一项有力工具。国内也有研究者(廖灿,黄以宁等,实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征.现代临床医学生物工程杂志,2004,10(4):310-312.)通过分管扩增目的基因及内参基因部分片段,采用实时荧光PCR的方法对21三体的分子诊断进行了初步探索。但分管实验中的一些因素,如孔间差异、模板加样差异等,都可以导致结果完全不同,造成错误的判断。此外,吕时铭等在申请号为200510049601.2、发明名称为″实时定量PCR技术来检测人21号染色体的数目的方法″的专利申请中公开了应用实时定量PCR技术来检测人21号染色体的数目的方法,但是该研究是选择21号染色体上的DSCR4作为目的基因,1号染色体上的RABIF基因作为参照基因,只能对21号染色体的数目做出检测,且该研究选择的Taqman探针是3′端采用荧光物质的TAMRA淬灭基因标记,增加了本底信号的干扰,影响结果的正确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法,应用多重实时荧光PCR相对定量法在同一反应管中同时检测人21及18号染色体数目。

本发明所述的一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法,包括以下步骤:

A.样品DNA提取:

按常规苯酚-氯仿法提取样本的DNA,检测DNA浓度及纯度;

B.引物设计和合成:

选择21号染色体21q21.3上的淀粉样前蛋白基因(APP基因MIM:188350;GeneID:7298)部分片段和18号染色体18p11.32上的胸苷酸合成酶基因(TYMS基因MIM:104760;GeneID:351)部分片段,设计相应引物,使得两基因部分片段在同一管中相互作为内参照同时扩增;并设计相应的Taqman探针,探针3′端标记非荧光性的淬灭基因Eclipse,5′端标记FAM或HEX荧光基团;

其中,针对21号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.1,下游引物序列为SEQ ID NO.2,相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.3;针对18号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.4,下游引物序列为SEQ IDNO.5,相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.6;

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