[发明专利]同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法

权利要求书

1.一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.样品DNA提取：

按常规苯酚-氯仿法提取样本的DNA，检测DNA浓度及纯度；

B.引物设计和合成：

选择21号染色体21q21.3上的淀粉样前蛋白基因部分片段和18号染色体18p11.32上的胸苷酸合成酶基因部分片段，设计相应引物，使得两基因部分片段在同一管中相互作为内参照同时扩增；并设计相应的Taqman探针，探针3′端标记非荧光性的淬灭基因Eclipse，5′端标记FAM或HEX荧光基团；

其中，针对21号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.1，下游引物序列为SEQ ID NO.2，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.3；针对18号染色体设计的上游引物序列为SEQ ID NO.4，下游引物序列为SEQ IDNO.5，相应的Taqman探针序列为SEQ ID NO.6；

C.多重实时荧光PCR扩增反应：

采用25ul反应体系，包含：模板DNA 2ul(60ng)，两对引物各300nmol/L，相应TaqMan荧光探针各200nmol/L，1×TaqMan通用PCR混合试剂12.5ul；该混合试剂中含有热启动DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、荧光染料ROX；

每个DNA标本进行3个平行管的扩增；

热循环条件为：50℃2分钟，95℃10分钟，然后95℃15秒，60℃1分钟，循环40次；

D.相对定量分析方法：

采用ABI7500型PCR仪随机附带软件进行荧光相对定量分析；

分析参数设定：阈值线设在对数期并超过无规则噪音线的最高处，不同批次采用同一阈值分析，将阈值设定为0.2；基线范围起点为第3个循环，终点为第19个循环；

仪器附带软件根据设定参数自动计算出CT值，APP基因部分片段的扩增产物与TYMS基因部分片段的扩增产物CT值之差为相对定量指标ΔCT值，取3个平行管ΔCT值的平均值；通过ΔCT值来确定21及18号染色体的数目。

2.一种同时对人21及18号染色体数目进行检测的试剂盒，包括多重荧光PCR反应液、热启动DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、荧光染料ROX，其特征在于，还包括：两对引物和相应的Taqman荧光探针；

所述第一对引物和相应的探针是针对21号染色体21q21.3上的淀粉样前蛋白基因部分片段设计的，包括：序列为SEQ ID NO.1的上游引物，序列为SEQ ID NO.2的下游引物；以及序列为SEQ ID NO.3的相应Taqman探针；

所述第二对引物和相应的探针是针对18号染色体18p11.32上的胸苷酸合成酶基因部分片段设计的，包括：序列为SEQ ID NO.4的上游引物，序列为SEQ ID NO.5的下游引物，以及序列为SEQ ID NO.6的相应Taqman探针；

探针3′端标记非荧光性的淬灭基因Eclipse，5′端标记FAM或HEX荧光基团。