[发明专利]一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法有效
| 申请号： | 200910100616.5 | 申请日： | 2009-07-13 |
| 公开（公告）号： | CN101603048A | 公开（公告）日： | 2009-12-16 |
| 发明（设计）人： | 谢雪钦;冯明光 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/74;C12N9/02;C12R1/19 |
| 代理公司： | 浙江杭州金通专利事务所有限公司 | 代理人： | 刘晓春 |
| 地址： | 310027*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法，它包括以下步骤：BbSod1基因的克隆；酿酒酵母Lys7基因的克隆；原核表达载体pET-BbSod1、pET-BbSod1-Lys7及pET-BbSod1-Mut的构建；重组质粒的扩增及蛋白表达及蛋白纯化。本发明巧妙地利用基因融合及定点突变技术，实现了BbSod1在技术体系成熟的原核表达体系中的高效表达。尤其所表达的BbSod1定点突变体BbSod1-Mut，工程菌株粗提物的SOD酶活相当于带分子伴侣的融合酶BbSod1-Lys7的2.8倍和无分子伴侣BbSod1的21.2倍；纯化BbSod1-Mut的SOD酶活相当于BbSod1-Lys7S的5.3倍。本发明有效克服了真核生物Cu/Zn-SOD对专一性分子伴侣CCS的普遍依赖性，为解决工业上从动植物中提取SOD的原料限制问题提供了基于原核工程菌株的新技术，具有重要的工业应用前景。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 真菌 cu zn sod 分子 伴侣 表达 方法 | ||
【主权项】：
1.一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法，其特征在于它包括对BbSod1基因的克隆，在获得BbSod1基因的基础上构建重组质粒pET-BbSod1-Mut，然后对重组质粒进行扩增及蛋白表达；所述BbSod1基因的克隆包括对BbSod1保守区序列的克隆，在BbSod1保守区序列的基础上获得BbSod1编码区序列，然后在BbSod1编码区序列的基础上再获得BbSod1 cDNA编码区序列；所述原核表达载体pET-BbSod1-Mut的构建是将BbSod1编码蛋白C末端的两个脯氨酸分别突变为丝氨酸和亮氨酸(P143S与P145L)，突变后的基因BbSod1-Mut经限制性酶酶切后插入原核表达载体中得到。
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