[发明专利]一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法

权利要求书

1.一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法，其特征在于它包括 对BbSod1基因的克隆，在获得BbSod1基因的基础上构建重组质粒 pET-BbSod1-Mut，然后对重组质粒进行扩增及蛋白表达；

所述BbSod1基因的编码区对应的DNA序列为序列表中的第8个序列中的外 显子区；

所述BbSod1基因的克隆包括对BbSod1保守区序列的克隆，在BbSod1保守 区序列的基础上获得BbSod1编码区序列，然后在BbSod1编码区序列的基础上 再获得BbSod1cDNA编码区序列；

所述原核表达载体pET-BbSod1-Mut的构建是将BbSod1编码蛋白C末端的 第143位的脯氨酸突变为丝氨酸，第145位的脯氨酸突变为亮氨酸，突变后的基 因BbSod1-Mut经限制性酶酶切后插入原核表达载体中得到；

所述BbSod1保守区序列克隆的简并引物序列为：

正向引物：5′-GACAAYACCAACGGCTGCAC-3′，

反向引物：5′-GGYACYGAYGAYCTYGG-3′；

所述BbSod1保守区序列以球孢白僵菌Bb2860(Beauveria bassiana(Balsamo) VueUemin)基因组为模板扩增得到；

所述BbSod1编码区的引物序列为：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3′，

反向引物：5′-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACC-3′；

用于定点突变BbSod1的引物为：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGGTCAAAGCAGTCTGTGTCC-3′，

反向引物：

5’-CCCAAGCTTGTTGGCAACGCCAATGACACCGCAGGCGAGGCGAGA TCCAGCG-3’；

所述编码区引物的扩增模板为球孢子白僵菌(Beauveria bassiana)2860菌株 总RNA逆转录所得的cDNA。

2.如权利要求1所述的一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方 法，其特征在于所述重组质粒pET-BbSod1-Mut的基因BbSod1-Mut经限制性内 切酶NdeI和HindIII消化后插入到原核表达载体。

3.如权利要求1所述的一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方 法，其特征在于所述蛋白表达的诱导条件为20℃和150r/min振荡诱导过夜。

4.如权利要求1所述的一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方 法，其特征在于所述蛋白表达的诱导时加入的IPTG、Cu²⁺和Zn²⁺离子浓度分 别为0.5mM、2.5mM和0.5mM。