[发明专利]一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种真菌Cu/Zn-SOD的免分子伴侣的原核 表达方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD；EC 1.15.1.1)系一类金属抗 氧化酶，广泛存在于生物体中，它能够催化超氧阴离子(O^2-)发生歧化反应，从而 清除自由基，在生物体防御氧化损伤的过程中发挥着重要作用(Fridovich I.1995. Superoxide radical and superoxide dismutases.Annu Rev Biochem 64：97-112.)。根据酶 分子中所含金属辅基的不同，SOD主要可分为Cu/Zn-SOD(多存在于真核生物)、 Mn-SOD(多存在于原核细胞和真核细胞线粒体)和Fe-SOD(存在于原核细胞和高等 植物叶绿体)等类型。SOD作为自由基清除剂，已被广泛应用于医药、食品和日用 化妆品等各个领域(方允中，李文杰。自由基与酶。科学出版社，1989)。在医药 上，SOD可用于治疗氧中毒、糖尿病、轻度烧伤及多种炎症等，在临床上都有较好 的效果。在食品工业上，由于SOD无毒，无副作用，可作为食品添加剂用于饮料、 口香糖及保健食品的生产。此外，在化妆品中添加SOD，可起到防止皮肤衰老和治 疗皮肤疾病的作用。

现在市售的SOD多数为从哺乳动物牛、猪等动物肝脏中提取，随着疯牛病、 口蹄疫、禽流感、猪流感等流行，安全性问题日渐凸显。另外，传统的提取方法还 存在原料有限、分离纯化困难、产量低等缺陷。因此，利用基因工程技术构建工程 菌株以实现SOD的高效、廉价化生产和制备无疑成为SOD规模化生产的有效途径。 相对于酵母、昆虫细胞等众多外源表达系统，大肠杆菌由于具有生长速度快、培养 基廉价、技术方案简单可行、载体及受体菌株多元化等优势而成为理想的基因工程 受体菌。

真核生物一般具有Cu/Zn-型和Mn-型两类SOD，其中多数的Cu/Zn-SOD都需 要专一的分子伴侣CCS来传递金属辅基Cu²⁺并催化分子间二硫键的形成而实现酶 的转录后激活。研究表明酿酒酵母CCS基因Lys7缺失突变株的Cu/Zn-SOD表达量 不变，但不具备清除氧自由基的活性(Culotta VC，Klomp LWJ，Strain J，Casareno RLB， Krems B，Gitlin JD.1997.The copper chaperone for superoxide dismutase.J Biol Chem 272：23469-23472)。真核生物Cu/Zn-SOD对专一分子伴侣的普遍依赖性无疑成为此 类活性蛋白在缺乏CCS的原核表达体系中实现高效表达的最大瓶颈。但是据报道， 在少数真核生物中仍存在不依赖于专一性分子伴侣CCS的Cu/Zn-SOD激活途径。 如人源的Cu/Zn-SOD(hSOD)在在缺失分子伴侣的情况下仍具有一定活性(Carroll MC，Girouard JB，Ulloa JL，Subramaniam JR，Wong PC，Valentine JS，Culotta VC.2004. Mechanisms for activating Cu and Zn-containing superoxide dismutase in the absence of the CCS Cu chaperone.Proc Natl Acad Sci USA，101：5964-5969)；秀丽广杆线虫 Caenorhabditis elegans的SOD(CeSOD)激活则完全不需要伴侣(Jensen LT，Culotta VC.2005.Activation of CuZn superoxide dismutases from Caenorhabditis elegans does not require the copper chaperone CCS.J Biol Chem 280：41373-41379)。通过三者序列 比对推测，酿酒酵母SOD对CCS的完全依赖性可能与其C末端存在的两个脯氨酸 有关。将hSOD(Carroll et al.，2004)和CeSOD(Jensen et al.，2005)中相应位点的氨基 酸突变为脯氨酸后，这两种酶在CCS缺失条件下亦失活。这一现象为我们改造真核 生物Cu/Zn-SOD，克服其对专一分子伴侣的依赖性，实现此类SOD在E.Coli体系 中的规模化生产提供了思路，但迄今这一技术路线未见在真菌中成功实施的案例。