[发明专利]传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法

摘要

本发明公开了传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法，包括DPOL基因纯化克隆和测序步骤，设计三对LAMP的引物BIP、FIP、B3、F3、LF、LB和一条探针FITC-Probe步骤，其中FIP为5’端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针，配制含三对引物和样品模板的LAMP反应体系步骤，对LAMP反应体系扩增步骤，用探针杂交然后用LFD检测步骤，本发明具有比现有技术的PCR检测ISKNV的方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在于实际生产中现场应用检测，有利于控制鱼类养殖中传染性脾肾坏死病毒的传染和暴发。

主权项

1、传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括下述步骤：(1)DPOL基因纯化克隆和测序：用母本质粒将ISKNV-的DNA聚合酶基因纯化克隆至重组质粒并进行ISKNV-DPOL基因测序分析，测得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列如下：1 ATGGATAGTG TGTACATCTA TCAGTGGCTC TATGCTAACT ATGAGGTGCG51 TGGCTACGGC ATAGCCCCAA ACAACACTGT AGTGTGTGTT CGTGTGCCCA101 ACTTTAAGCA AGTGGTGTAT GTCGAATGCA CCGACCCACA ACAGCATGAC151 CCACGTTCCA CATTCACCCA GCACGGGTTC AGGGTCTATG AGACGCCCCG201 GGCGTGTAGC CTGTATGGCG CAAAGGGGGT GGGCACATAC TTTGCCGCAC251 GCGTGCCCAA CTACAATGCC ATGCGCGATG TACAGGAGAC ACAGGGTGCA301 TTTAAGATAC ATGAGTCGCG TGTTAGCAAG ACGATGGAGT TCACAGCACG351 CGCCGGCCTG CCGACCGTTG GCTGGATACA GGTGTCGCAG CGATGTGTGG401 TGACGCGCAC TGTAACAATG GCAGCCAAAG AGTACATGGT GCCTAACTGG451 CGTACCGATG TCAGGCCGGC CCCGGACATG GAGGGCGTGC CGCCGGCAAA501 GATTGTTTAC TTTGACATTG AGGTCAAGTC CGACCATGAA AACGTGTTCC551 CCAGTGACAG GGACGACGAG GTGATATTTC AGATAGGCCT GGTGCTGTGT601 AGTGGCAACA CGGTGCTGCG CACTGACCTT CTCTCCTTGC CCGGCCGCGA651 TTACGACGAC TCTGTGTACC AGTACGCCAC AGAAGGCGAG CTGCTGCACG701 CATTCATAGC CTACATCAGG GAACACGAGG TGGTGGCTGT GTGTGGCTAC751 AACATCATGG GCTTTGACAT ACCGTACATT ATCAAGAGGT GCGCACGCAC801 CTCCATGCTG GGCACCCTCA GGCGCATCGG CTTTGATAAC CGCAGGCTGG851 CCATAGAGAA GACGGCCGGT GTCGGCTACG CAAAGATGAC ATACATACAA901 TGGGAAGGCG TCTTGACAAT AGATCTGATG CCCATTATCA TGATGGATCA951 CAAGCTCGAC TCGTACAGCC TGGACTATGT GGCCAACCAC TTTGTCAAGG1001 CGGGCAAGGA CCCCATTCGC CCCAGGGACA TCTTTCACGC CTATAACACG1051 GGCATGATGG CACGCGTGGG GCGCTACTGT GTGAAGGACA CGCAGCTGTG1101 CAAGCAACTG GTCGACTACC TCAATACGTG GGTGGCGCTG TGCGAGATGG1151 CCGGCGTGTG TAACACATCC ATTATGCAAC TGTTTACCCA GGGCCAGCAG1201 GTCCGGGTGT TTGCGCAGAT CTATCGTGAC TGCACGCCAA TGGACGTGGT1251 CGACAAGGTG TATGTCATTC CGGATGGTGG CTGTGACTCG GATGTGGTGT1301 CCCCTTCGTC ATATACGGGC GCATATGTGT ATGAGCCGGT GCCCGGCGTG1351 TACAAGAACG TGATACCCAT GGACTTCCAG AGCCTGTATC CGAGCATCAT1401 CATATCCAAG AACATATGCT ACAGCACCTT GGTGGACCAG GGCGGCGAAG1451 AGTATGCGTG GCAAGAGCAC GAAGGCTGCG AGCACGACCC GCAGTATGCA1501 AAACAACACG CCCTTGGCAT CGAGATTGGT GTCTTGCAAT GCAACATGGC1551 AGCGCTTCCG CGACGCGCCA CCCAAGAGCG GGCCAGGCTG CGTGAGCGCA1601 TAGCAGACAT GAAGATCCAG TATGCTAGCA TGACACCTGC GGCAGTCAAG1651 TGTAACGTCT TCAGCTTCAG GTTCACGCAT GCTCACGAAG GCGTGCTGCC1701 ACGTGTGCTC CGTAACCTGC TGGAGAGCAG GGCCCGCATA CGGGCGCGCA1751 TCAAGACCAC AGACGACCCC GACATTAGGG CAGTTCTGGA CAAGAGGCAG1801 CTGGCGTACA AGATAAGCGC CAACTCGGTG TACGGCACCA TGGGCACGCA1851 GAGGGGCTAC CTGCCGTTTA TGGCGGGGGC AATGACGACG ACGTACTGTG1901 GCCGCAAGCT GATTGAGAAG GCCGCTCATC TCCTTAAGAC GGTGGTGGGC1951 GCTACCATTG TGTACGGCGA CACCGACTCG TGCTACATAC AGCTGGGCCA2001 CGACCGCGCA TCACTCGATG AACTGTGGCA GATGGCCGTG AACGCCAGCG2051 ACACCGTGTC GGCCTTCTTT GAGCGCCCGG TGCGCCTCGA GTTTGAGCAG2101 TGCATCTACA CCAAGTTTAT CATCTTCACC AAGAAACGTT ATGTGTACAG2151 GGCATTCACA CGCGACGGCA AGCAGCGAAC AGGCAGCAAG GGTGTGATGC2201 TGTCCAGACG CGACAGCGCC ATGTGTGCCA GAAACACGTA TGCGGCAATC2251 ATGAACACGA TCCTTGAGGG ATCTGCAGAT GTGCCGTTCA TTGCCGCGTG2301 CATGATGCAC GACATGATGA TACCGGGAGC GCTTCAAGAC GACGACTTTG2351 TGCTGACAAA GAGTGTGCAG GACATTGGCA ATGGGGACGA TAACAACCAG2401 GGCTCGTACA AAGTCAGGAA TCCACAGAAG GCGCAGGCGG CGGCCACCCA2451 AAGGGTAGCC CCGGACGATG CCGAAGGGTA CGCCATCGCG CTGCGGCAGG2501 AAATGGTGAA GCAGATGCCT GCGCAGGCAC AATTGGCAGA GCGCATGAGA2551 CTGCAGGGCC GCGCCGTGGT CAGTGGCGCT CGCATCGAGT ATGTCGTTCT2601 TAAGCACCAA TATGGTGTGC CTGAGGGCGC CCTGGGGGCA AGGCTGTTGG2651 ATTTTGAGCG GTGGCGCGAA ATGAAGGTGG CCTATCCACT GGATCGGCTG2701 TACTACATGA AAAGTGTGGT CAACGCATGC GACCAGCTAC TTGTTACGGC2751 CGGCTACGGG CCCGTGTGCA GCAAGGTATA TGCGGCGCAC TTACAGTTGG2801 CGTACGTGCA CAAACAGTTA CTGAGACGCA CGACGCCTGC CGTATGA(2)设计LAMP的引物和探针：根据上述测序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列进行设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列：BIP引物：5’-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3’45FIP引物：5’-CACGCGGCAA TGAACGGCAC ATTTTGCCAG AAACACGTAT GCGGC-3’45B3引物：5’-GCTACCCTTT GGGTGGC-3’17F3引物：5’-GACGCGACAG CGCCATGT-3’18LF引物：5’-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3’20LB引物：5’-AACCAGGGCT CGTACAAAGT-3’20FITC-Probe探针：5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’21其中FIP为5’端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针；(3)配制LAMP反应体系：反应体系的终浓度分别为：外引物F3和B3各0.2μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，0.1％ Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(NeW EnglandBIPolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；(4)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65℃，扩增反应时间为10-60min。(5)探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的FITC-probe探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μL buffer中混匀，然后将LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。