[发明专利]传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法

权利要求书

1.非诊断目的的传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括下 述步骤：

(1)DPOL基因纯化克隆和测序：将ISKNV的DNA聚合酶基因纯化克隆至pMD19-T 得到重组质粒并进行ISKNV-DPOL基因测序分析，测得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序 列如下：

1    ATGGATAGTG TGTACATCTA TCAGTGGCTC TATGCTAACT ATGAGGTGCG

51   TGGCTACGGC ATAGCCCCAA ACAACACTGT AGTGTGTGTT CGTGTGCCCA

101  ACTTTAAGCA AGTGGTGTAT GTCGAATGCA CCGACCCACA ACAGCATGAC

151  CCACGTTCCA CATTCACCCA GCACGGGTTC AGGGTCTATG AGACGCCCCG

201  GGCGTGTAGC CTGTATGGCG CAAAGGGGGT GGGCACATAC TTTGCCGCAC

251  GCGTGCCCAA CTACAATGCC ATGCGCGATG TACAGGAGAC ACAGGGTGCA

301  TTTAAGATAC ATGAGTCGCG TGTTAGCAAG ACGATGGAGT TCACAGCACG

351  CGCCGGCCTG CCGACCGTTG GCTGGATACA GGTGTCGCAG CGATGTGTGG

401  TGACGCGCAC TGTAACAATG GCAGCCAAAG AGTACATGGT GCCTAACTGG

451  CGTACCGATG TCAGGCCGGC CCCGGACATG GAGGGCGTGC CGCCGGCAAA

501  GATTGTTTAC TTTGACATTG AGGTCAAGTC CGACCATGAA AACGTGTTCC

551  CCAGTGACAG GGACGACGAG GTGATATTTC AGATAGGCCT GGTGCTGTGT

601  AGTGGCAACA CGGTGCTGCG CACTGACCTT CTCTCCTTGC CCGGCCGCGA

651  TTACGACGAC TCTGTGTACC AGTACGCCAC AGAAGGCGAG CTGCTGCACG

701  CATTCATAGC CTACATCAGG GAACACGAGG TGGTGGCTGT GTGTGGCTAC

751  AACATCATGG GCTTTGACAT ACCGTACATT ATCAAGAGGT GCGCACGCAC

801  CTCCATGCTG GGCACCCTCA GGCGCATCGG CTTTGATAAC CGCAGGCTGG

851  CCATAGAGAA GACGGCCGGT GTCGGCTACG CAAAGATGAC ATACATACAA

901  TGGGAAGGCG TCTTGACAAT AGATCTGATG CCCATTATCA TGATGGATCA

951  CAAGCTCGAC TCGTACAGCC TGGACTATGT GGCCAACCAC TTTGTCAAGG

1001 CGGGCAAGGA CCCCATTCGC CCCAGGGACA TCTTTCACGC CTATAACACG

1051 GGCATGATGG CACGCGTGGG GCGCTACTGT GTGAAGGACA CGCAGCTGTG

1101 CAAGCAACTG GTCGACTACC TCAATACGTG GGTGGCGCTG TGCGAGATGG

1151 CCGGCGTGTG TAACACATCC ATTATGCAAC TGTTTACCCA GGGCCAGCAG

1201 GTCCGGGTGT TTGCGCAGAT CTATCGTGAC TGCACGCCAA TGGACGTGGT

1251 CGACAAGGTG TATGTCATTC CGGATGGTGG CTGTGACTCG GATGTGGTGT

1301 CCCCTTCGTC ATATACGGGC GCATATGTGT ATGAGCCGGT GCCCGGCGTG

1351 TACAAGAACG TGATACCCAT GGACTTCCAG AGCCTGTATC CGAGCATCAT

1401 CATATCCAAG AACATATGCT ACAGCACCTT GGTGGACCAG GGCGGCGAAG

1451 AGTATGCGTG GCAAGAGCAC GAAGGCTGCG AGCACGACCC GCAGTATGCA

1501 AAACAACACG CCCTTGGCAT CGAGATTGGT GTCTTGCAAT GCAACATGGC

1551 AGCGCTTCCG CGACGCGCCA CCCAAGAGCG GGCCAGGCTG CGTGAGCGCA

1601 TAGCAGACAT GAAGATCCAG TATGCTAGCA TGACACCTGC GGCAGTCAAG

1651 TGTAACGTCT TCAGCTTCAG GTTCACGCAT GCTCACGAAG GCGTGCTGCC

1701 ACGTGTGCTC CGTAACCTGC TGGAGAGCAG GGCCCGCATA CGGGCGCGCA

1751 TCAAGACCAC AGACGACCCC GACATTAGGG CAGTTCTGGA CAAGAGGCAG

1801 CTGGCGTACA AGATAAGCGC CAACTCGGTG TACGGCACCA TGGGCACGCA

1851 GAGGGGCTAC CTGCCGTTTA TGGCGGGGGC AATGACGACG ACGTACTGTG

1901 GCCGCAAGCT GATTGAGAAG GCCGCTCATC TCCTTAAGAC GGTGGTGGGC

1951 GCTACCATTG TGTACGGCGA CACCGACTCG TGCTACATAC AGCTGGGCCA

2001 CGACCGCGCA TCACTCGATG AACTGTGGCA GATGGCCGTG AACGCCAGCG

2051 ACACCGTGTC GGCCTTCTTT GAGCGCCCGG TGCGCCTCGA GTTTGAGCAG

2101 TGCATCTACA CCAAGTTTAT CATCTTCACC AAGAAACGTT ATGTGTACAG

2151 GGCATTCACA CGCGACGGCA AGCAGCGAAC AGGCAGCAAG GGTGTGATGC

2201 TGTCCAGACG CGACAGCGCC ATGTGTGCCA GAAACACGTA TGCGGCAATC

2251 ATGAACACGA TCCTTGAGGG ATCTGCAGAT GTGCCGTTCA TTGCCGCGTG

2301 CATGATGCAC GACATGATGA TACCGGGAGC GCTTCAAGAC GACGACTTTG

2351 TGCTGACAAA GAGTGTGCAG GACATTGGCA ATGGGGACGA TAACAACCAG

2401 GGCTCGTACA AAGTCAGGAA TCCACAGAAG GCGCAGGCGG CGGCCACCCA

2451 AAGGGTAGCC CCGGACGATG CCGAAGGGTA CGCCATCGCG CTGCGGCAGG

2501 AAATGGTGAA GCAGATGCCT GCGCAGGCAC AATTGGCAGA GCGCATGAGA

2551 CTGCAGGGCC GCGCCGTGGT CAGTGGCGCT CGCATCGAGT ATGTCGTTCT

2601 TAAGCACCAA TATGGTGTGC CTGAGGGCGC CCTGGGGGCA AGGCTGTTGG

2651 ATTTTGAGCG GTGGCGCGAA ATGAAGGTGG CCTATCCACT GGATCGGCTG

2701 TACTACATGA AAAGTGTGGT CAACGCATGC GACCAGCTAC TTGTTACGGC

2751 CGGCTACGGG CCCGTGTGCA GCAAGGTATA TGCGGCGCAC TTACAGTTGG

2801 CGTACGTGCA CAAACAGTTA CTGAGACGCA CGACGCCTGC CGTATGA

(2)设计LAMP的引物和探针：根据上述测序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷 酸序列进行设计下述LAMP的三对引物序列和一条探针序列：

BIP引物：5’-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3’45

FIP引物：5’-CACGCGGCAA TGAACGGCAC ATTTTGCCAG AAACACGTAT GCGGC-3’45

B3引物：5’-GCTACCCTTT GGGTGGC-3’17

F3引物：5’-GACGCGACAG CGCCATGT-3’18

LF引物：5’-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3’20

LB引物：5’-AACCAGGGCT CGTACAAAGT-3’20

FITC-Probe探针：5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’21

其中FIP为5’端生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针；

(3)配制LAMP反应体系：反应体系的终浓度分别为：外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6μmol/L，环引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs 0.96mmol/L，pH 8.8的Tris-HCl 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄6.5mmol/L， (NH4)₂SO410mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段和1μL样品模 板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL；

(4)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61-65 ℃，扩增反应时间为10-60min；

(5)探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的FITC-probe探针加入反应体系 中，63℃温育5min，进行杂交，取8μL杂交液加入100μL缓冲液中混匀，然后将 LFD试纸条浸入取出的杂交液显色检测，判断横向流动试纸条检测LAMP的结果。

2.如权利要求1所述的非诊断目的的传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法， 其特征在于步骤4中所述的扩增反应温度为65℃，扩增反应时间为20min。