[发明专利]传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及传染性脾肾坏死病毒的检测方法，具体涉及传染性脾肾坏死病毒的LAMP-LFD检测方法。 

背景技术

虹彩病毒是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原，由其感染所致的疾病已成为世界水产养殖业的严重问题。根据国际病毒分类委员会(International Committee On Taxonomy of Viruses，ICTV)第八个病毒报告，传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)为虹彩病毒科细胞肿大病毒属代表种，是大型二十面体细胞质型线性双链DNA病毒，直径大小约为150nm。它能引起全身性、系统性地感染，对感病鱼的脾脏、肾脏等造血器官和组织造成严重破坏，导致病鱼贫血、多器官衰竭而死亡。ISKNV是许多重要养殖鱼类如鳜鱼、花鲈、大黄鱼及重要的观赏鱼类如蓝眼灯和丽丽鱼等的爆发性流行病的病原，这类病毒侵染鱼体流行快，极易引起鱼的暴发性死亡，给我国水产养殖业造成巨大经济损失。因此快速、准确、灵敏的检测ISKNV的新技术，对控制早期病毒感染、切断病毒传播，保障我国鱼类水产养殖业的健康持续发展具有重要意义。 

目前公开的ISKNV检测方法的是采用PCR检测体系，实现了实验室条件下对ISKNV的简便、快速、敏感、特异检测。如授权公告号为CN11864359C，公告日为2005年1月26日，发明名称为鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因诊断试剂盒及检测方法，就公开了设计有二对引物的PCR反应液对样品模板进行PCR扩增反应检测。但PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)以及分子生物学专业实验人员操作，这只能在实验室条件下才可以检测，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。 

环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi(2000年)发明的一种新式恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温条件下(65℃左右)高效(30min～1h)扩增目标DNA。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料目测观察等方法。 

横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)是一种新的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏 度。LFD检测无许特殊的设备，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，并且不需EB等有毒试剂，操作简便且更安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势。目前，该技术已被用于桃拉病毒(Taura syndrome virus，TSV)(Kiatpathomchai et al.，2008)，对虾白斑症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)(Kiatpathomchai et al.，2008)，传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV)(Puthawibool et al.，2008)的检测，传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的检测未见报道。本发明第一次将LAMP技术和LFD技术结合并用于传染性脾肾坏死病毒的检测。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱横向流动试纸条检测传染性脾肾坏死病毒的方法，以实现对传染性脾肾坏死病毒进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用PCR检测传染性脾肾坏死病毒不能在生产中应用的问题。