[发明专利]测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法

摘要

本发明公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是合成氨基无色孔雀石绿的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原，通过免疫动物获得兔抗无色孔雀石绿的多克隆抗体，ELISA标准曲线的浓度范围为0.1～100ng/mL，IC₅₀为0.9-2.6ng/mL，加标回收率为76.2-95.0％，ELISA与HPLC的相关系数为0.975，n＝7；由于所制抗体与孔雀石绿的交叉反应率分别为95.25％，故ELISA可以用于测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量，而无需将任何氧化步骤。

主权项

1. 测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)无色孔雀石绿衍生物的制备取5. 5～7.5g对硝基苯甲醛溶于14～18g N，N-二甲基苯胺中，加入4.8～6.8g ZnCl2，于温度80～100℃搅拌反应直至绿色溶液形成固体，冷却至室温，固体溶于丙酮，同时过滤除去ZnCl2颗粒，粗产品过柱纯化、干燥，得硝基无色孔雀石绿黄色粉末，取0.17～0.27g硝基无色孔雀石绿溶于6～10mL甲醇中，以5％钯碳为催化剂，加入反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，粗产品用体积比为95∶5的甲醇∶苯混合液重结晶，得到氨基无色孔雀石绿白色粉末；(2)免疫原及包被抗原的制备取30～40mg纯化的氨基无色孔雀石绿溶于0.6mL水中，缓慢滴加浓度为15mg/mL的NaNO2溶液0.33mL，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，在暗处、温度4℃反应过夜，取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；将10.5mg氨基磺酸胺溶于0.21mL纯水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应；称取牛血清白蛋白和卵清蛋白各100mg，分别溶于1.5mL浓度为0.01mol/L pH