[发明专利]测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法

说明书

一.技术领域

本发明涉及一种测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。

二.背景技术

孔雀石绿(Malachite Green，MG)又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿和中国绿，为带有金属光泽的绿色结晶体，化学名称：四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C₂₃H₂₅N₂Cl，分子量为364.92，易溶于水、甲醇和乙醇，溶液呈蓝绿色。孔雀石绿是一种人工合成的三苯基甲烷类工业染料，主要用于制陶、纺织、皮革和食品等产业上的颜色剂和细胞化学上的染色剂等。孔雀石绿具有抗菌、杀虫等功效，是药用染料中抗菌效力较强的一类，被广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫，原生动物和鱼卵中的霉菌等。孔雀石绿对防治水霉病等有特效，在水产养殖中曾大量使用。孔雀石绿在生物体内会很快转化为无色孔雀石绿(Leucomalachite Green，LMG)。无色孔雀石绿是孔雀石绿在生物体内的主要代谢物和主要存在形式。孔雀石绿及无色孔雀石绿在环境水体和水生物体内均可存留较长时间。

近年来国内外研究表明孔雀石绿为潜在的致癌、致畸、致突变物质，而其代谢物无色孔雀石绿被确证具有高毒、高残留和三致作用，因此，孔雀石绿的使用污染水环境，其代谢物无色孔雀石绿对水生物及人体健康造成极大危害。美国、加拿大、日本、欧盟等许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。欧盟规定水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量不得超过2μg/kg。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。

测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的主要方法是色谱分析方法，包括气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。HPLC-紫外可见检测器(UV)为最常用的检测方法。孔雀石绿的最大吸收波长为618nm，利用HPLC-UV检测，背景干扰小，测量结果准确。无色孔雀石绿在可见区无吸收，利用HPLC-UV检测，背景干扰严重，难以获取精确的结果，故常利用氧化剂如二氧化铅或2，3-二氯-5，6-氰基-1，4-苯醌将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿后进行检测。无色孔雀石绿也可利用高效液相色谱-荧光检测法检测。色谱分析方法虽然灵敏度较高、准确性较好，但是色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高，不适用于大量样品的筛选。

酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，已广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。到目前为止，仅有一篇用ELISA测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的文献报道(Yang，et al.J.Agric.Food Chem.2007.55，8851-8856)，但抗体的交叉反应小，孔雀石绿或无色孔雀石绿只能由相应的抗体所建立的ELISA测定。最近，测定孔雀石绿或无色孔雀石绿总量的ELISA试剂盒也已上市(BioscientificCom)，但此试剂盒价格昂贵，且需要一个额外的样品处理步骤，即在测定前须将无色孔雀石绿氧化成孔雀石绿。

三.发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是利用抗无色孔雀石绿抗体与孔雀石绿的高交叉反应率，同时测定孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量，而无需氧化步骤。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。

测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析法

(1)无色孔雀石绿衍生物的制备

取5.5～7.5g对硝基苯甲醛溶于14～18g N，N-二甲基苯胺中，加入4.8～6.8g ZnCl₂，于温度80～100℃搅拌反应直至绿色溶液形成固体，冷却至室温，固体溶于丙酮，同时过滤除去ZnCl₂颗粒，粗产品过柱纯化、干燥，得硝基无色孔雀石绿黄色粉末，取0.17～0.27g硝基无色孔雀石绿溶于6～10mL甲醇中，以5％钯碳为催化剂，加入反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，粗产品用体积比为95:5的甲醇:苯混合液重结晶，得到氨基无色孔雀石绿白色粉末；

(2)免疫原及包被抗原的制备