[发明专利]测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法

权利要求书

1.测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)无色孔雀石绿衍生物的制备

取5.5～7.5g对硝基苯甲醛溶于14～18g N，N-二甲基苯胺中，加入4.8～6.8g ZnCl₂，于温度80～100℃搅拌反应直至绿色溶液形成固体，冷却至室温，固体溶于丙酮，同时过滤除去ZnCl₂颗粒，粗产品过柱纯化、干燥，得硝基无色孔雀石绿黄色粉末，取0.17～0.27g硝基无色孔雀石绿溶于6～10mL甲醇中，以5％钯碳为催化剂，加入反应釜中，通入氢气，于温度100～120℃反应1～5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，粗产品用体积比为95:5的甲醇:苯混合液重结晶，得到氨基无色孔雀石绿白色粉末；

(2)免疫原及包被抗原的制备

取30～40mg纯化的氨基无色孔雀石绿溶于0.6mL水中，缓慢滴加浓度为15mg/mL的NaNO₂溶液0.33mL，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，在暗处、温度4℃反应过夜，取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；将10.5mg氨基磺酸胺溶于0.21mL纯水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应；

称取牛血清白蛋白和卵清蛋白各100mg，分别溶于1.5mL浓度为0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至上述蛋白质溶液中，用NaOH溶液调节pH值为7.5，搅拌下于温度4℃反应过夜；将混合物离心，取上清，装入透析袋中，透析数天，获得两种无色孔雀石绿-蛋白质溶液，冷冻干燥，在温度-20℃保存待用；无色孔雀石绿-牛血清白蛋白和无色孔雀石绿-卵清蛋白分别用作免疫原及包被抗原；

(3)无色孔雀石绿多克隆抗体的制备

用免疫原免疫两只新西兰大白兔，将1～4mg免疫原溶于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5～2.0mL乳浊液，多点皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行第二次免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，即得兔抗无色孔雀石绿多克隆抗体；

(4)建立测定无色孔雀石绿含量的酶联免疫吸附分析方法

对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的ELISA；

(5)ELISA对加标样品中无色孔雀石绿含量的测定

选择了4种样品：自来水，食用鱼养殖水样，鱼样I，鱼样II进行加标实验，不同加标样品萃取方法不同，(1)水样：自来水不需任何预处理，食用鱼养殖水样用0.45μm的滤膜过滤，取水样1mL，加入LMG储备液，使水样LMG加标浓度分别为1，2，5ng/mL；(2)：鱼样：称取1.0g鱼样品于10mL离心管中，加入LMG储备液，使鱼样LMG中加标浓度为20，50，100μg/g，样品室温下放置30min，加入3ml乙腈，涡旋混匀5min，超声波振荡提取15min，4000r/min离心10min，上清液转至25mL梨型瓶中，重复上述步骤，合并两次萃取液，将收集液在35℃下减压旋转蒸发至体积约2～3mL，移取样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上，4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，45℃旋转蒸发至干，用1.00mL 0.01％酪蛋白溶液溶解后待测；无色孔雀石绿加标回收率在76.2-95.0％之间，相对标准偏差为2.7-13.1％，说明方法准确性和精密度都比较好；

(6)ELISA和HPLC的比较

无色孔雀石绿的HPLC条件为：Agilent高效液相色谱仪，配备荧光检测器，柱温35℃，流动相为体积比80:20的乙腈:0.125mol/L HAc/NH₄Ac，pH 4.5的混合液，流速为1.3mL/min，进样50μL，荧光激发波长265nm，荧光发射波长360nm，无色孔雀石绿标准溶液进样量分别为1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0ng，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；

所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，7种加标样品，即食用鱼养殖水样，加标浓度5μg/L；鱼样I，加标浓度20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg；鱼样II，加标浓度20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg；加标样品用上述方法处理并用ELISA和HPLC测定，测定结果以HPLC为横坐标，ELISA为纵坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝1.0305X-0.7307，相关系数为0.975，n＝7，说明二者的相关性很好。