[发明专利]克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法

摘要

本发明公开了一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括(1)选材：三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后选取无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养基上培养；(3)将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上培养；(4)将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上培养形成幼苗；(5)壮苗生根培养；(6)再生植株移栽、成活。本发明可有效地克服三叶草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率，提高育种效率。

主权项

1、一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：(1)选材：三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片三种外植体；(2)胚发生愈伤组织诱导：将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱导培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养28～30天；(3)胚继代形成培养：将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～6℃低温人工气候箱暗培养，然后在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养30-35天；(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～1500lx的条件下进行14h/d的光培养20～25天，形成幼苗；(5)壮苗生根培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；(6)生根的再生植株移栽、成活；所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为：改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L6-BA+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂。