[发明专利]克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种豆科牧草的高频体胚再生培养方法，更具体的讲涉及一种 克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，属于植物学领域。

背景技术

三叶草(Clover)是一种世界性分布与栽培的优良豆科牧草，是温带地区 人工草地建植的首选草种，也是各类观赏性草坪和绿地的主要组分，它在城镇的 绿化、美化、果园林木的固氮培肥地力、道路堤坝的水土保持等方面均起着不 可替代的重要作用。鉴于三叶草的重要经济价值，许多发达国家纷纷利用生物技 术方法来研究改良三叶草，解决三叶草生产中存在的问题。

三叶草是个异质杂合体，自交不亲和，目前世界各国应用的品种80％以上为 综合品种，品种内基因型差异很大，三叶草一些重要的育种目标很难通过常规 育种方法达到，如三叶草抗旱耐盐、抗病抗虫、提高种子及草产量、固氮能力 等都达不到理想的效果，因此近年来，人们试图通过现代基因工程技术，即通过 转基因获得抗性植株来培育三叶草新品种，提高三叶草对各种生态环境的适应 性，但作为这种技术能成功应用的前提条件是三叶草在其组织培养过程中具有 高频体胚再生能力，这一直是一个难以克服的问题。

三叶草属植物组织培养再生技术的研究始于20世纪70年代，已有的一些 报道表明，大部分三叶草的组织培养再生率都极低，只有1％甚至更小，且再生 过程较长，一般需4～6个月左右，再生性和再生频率易受基因型影响，这已经 成为限制不同基因型，尤其是优良品种转基因的瓶颈。Nancy和Jerzy 1989年 通过红三叶叶柄愈伤组织的诱导，获得了70～81％的植株再生率；Quesenberry 和Smith1993年报道了红三叶再生技术的研究，大约有4％的植株再生率比较高， 若在这4％再生率高的植株中再进一步筛选和再生，植株的再生力会提高到70％。 三叶草再生体系的建立多是通过器官发生途径，很少有从体细胞胚胎发生途径 建立的报道，更未见有适宜于三叶草基因转化的高频率体细胞胚再生组织培养 技术体系的报道。由于体细胞胚是克隆起源的，体胚发生途径更能保证转基因 植物的遗传一致性(不形成嵌合体)，使外源基因可通过花粉和配子传递给后代。 所以，体胚再生技术是植物组织培养中最有吸引力的方法，被广泛应用于植物 遗传转化、体细胞变异系的筛选等。

先前的研究者大多只选择了1个种的1～3个品种为材料，由于研究的品种 数量少，不具代表性，这些研究均难以解决三叶草不同品种及基因型障碍的问 题。因此，建立三叶草不受品种及基因型限制的高频体胚再生培养体系是获得 各类品种三叶草转基因成功的重要前提。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可有效提高体 细胞胚发生频率和再生植株频率的克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再 生培养方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：

(1)选材：三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化 培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片 三种外植体；

(2)胚发生愈伤组织诱导：将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱 导培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养28～30 天；

(3)胚继代形成培养：将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种 于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～6℃低温人工气候箱暗培养，然后 在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养30-35天；

(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚 成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～ 1500lx的条件下进行14h/d的光培养20～25天，形成幼苗；

(5)壮苗生根培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生 长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；

(6)生根的再生植株移栽、成活；

所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；

所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为：改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～ 0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；