[发明专利]克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法

权利要求书

1.一种克服三叶草品种基因型障碍高频体胚再生培养方法，包括以下步骤：

(1)选材：三叶草成熟种子经冲洗、消毒杀菌、干燥后，在幼苗生长驯化 培养基上培养无菌苗，选取萌发后的无菌苗的上胚轴、下胚轴和再生植株叶片 三种外植体；

(2)胚发生愈伤组织诱导：将上述选取的外植体接种于胚发生愈伤组织诱 导培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养28～30 天；

(3)胚继代形成培养：将上述经胚发生愈伤组织诱导培养后的外植体接种 于胚继代形成培养基上，首先进行5天的4～6℃低温人工气候箱暗培养，然后 在白天室温27±2℃、夜晚室温20±1℃的条件下暗培养30-35天；

(4)胚成熟萌发成苗培养：将上述经胚继代形成培养后的外植体接种于胚 成熟萌发成苗培养基上，在白天室温27±2℃、夜晚20±1℃、光照强度为1000～ 1500lx的条件下进行14h/d的光培养20～25天，形成幼苗；

(5)壮苗生根培养：将上述经胚成熟萌发成苗培养后的幼苗转接到幼苗生 长驯化培养基上进行壮苗生根培养，形成生根的再生植株；

(6)生根的再生植株移栽、成活；

所述的幼苗生长驯化培养基为：1/2改良MS+20g/L白糖+0.7％琼脂；

所述的胚发生愈伤组织诱导培养基为：改良SH+8～12mg/L 2，4-D+0.2～ 0.5mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+0.3％phytagel；

所述的胚继代形成培养基为：改良SH+2～8mg/L 2，4-D+0.2～0.5mg/L 6-BA+50g/L蔗糖+0.35％phytagel；

所述的胚成熟萌发成苗培养基为：改良MS+30g/L白糖+0.7％琼脂，

所述的改良SH和改良MS培养基都包括常量营养元素、微量营养元素和有 机试剂，

其中，改良SH包括的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

硫酸铵                    463mg/L；

硝酸钾                    2830mg/L；

二水氯化钙                166mg/L；

七水硫酸镁                185mg/L；

无水磷酸二氢钾            400mg/L；

乙二胺四乙酸铁钠盐        1.4mg/L；

改良SH包括的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

一水硫酸锰                10mg/L；

硫酸锌                    1.0mg/L；

硼酸                      5.0mg/L；

碘化钾                    1.0mg/L；

钼酸钠                    0.1mg/L；

硫酸铜                    0.2mg/L；

氯化钴                    0.1mg/L；

改良SH包括的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：

盐酸硫胺素                5.0mg/L；

烟酸                      5.0mg/L；

盐酸吡哆醇                5.0mg/L；

而所述的改良MS培养基包括的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

硫酸铵                    1650mg/L；

硝酸钾                    1900mg/L；

七水硫酸镁                370mg/L；

无水磷酸二氢钾            170mg/L；

二水氯化钙                440mg/L；

乙二胺四乙酸二钠          37.3mg/L；

七水硫酸亚铁              27.8mg/L；

改良MS培养基包括的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：

四水硫酸锰                22.3mg/L；

硫酸锌                    8.6mg/L；

硼酸                      6.2mg/L；

碘化钾                    0.83mg/L；

钼酸钠                    0.25mg/L；

硫酸铜                    0.025mg/L；

氯化钴                    0.025mg/L；

改良MS培养基包括的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：

盐酸硫胺素                1.0mg/L；

烟酸                      1.0mg/L；

盐酸吡哆醇                1.0mg/L；

肌醇                      100mg/L。