[发明专利]一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法

摘要

本发明提供了一种梨花粉和花粉管微丝骨架的荧光标记方法，属于生物技术领域。包括采集成熟花粉，在培养基中分别培养花粉0.5h和2h，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L MBS(顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定5-10min后分别用2％多聚甲醛和4％多聚甲醛各固定0.5h，洗涤花粉(管)，用终浓度为5μg/ml[含5％DMSO(二甲基亚砜)]的FITC-ph染色液(异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色液)，在25℃避光下染色0.5-1h，微丝骨架被荧光标记。本发明具有操作简单、快速、标记效果好、对微丝骨架结构破坏小等特点，可用于蔷薇科植物花粉(管)的开发利用，实际应用价值高。

主权项

1、一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括：1)花粉的采集：采集开花当天的花粉，采集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密封，-20℃低温保存；2)花粉培养基按照质量比制备：蔗糖，10％；聚乙二醇PEG4000，15％；H3BO3，0.01％；Ca(NO3)2·4H2O，0.03％；MgSO4·7H2O，0.02％；KNO3，0.01％；溶剂，水；用30mmol/L的2-(N-吗啉基)乙磺酸MES缓冲液调pH值至6.5；3)花粉的培养：取步骤1)干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在恒温25℃黑暗条件下分别培养0.5h或2h，培养0.5h的花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花粉管，用于花粉管内微丝骨架的荧光标记与观察；4)预固定：培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS预固定5-10min；5)固定：然后用含有质量比2％多聚甲醛和质量比4％多聚甲醛、pH为6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液PBS室温条件下固定花粉或花粉管0.5h；0.1mol/L PBS缓冲液的配制：NaH2PO4·2H2O2.964g和Na2HPO4·12H2O28.998g加蒸馏水定容至1000ml，pH6.8；6)洗涤：用0. 1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，去除清洗液；7)染色液的配制：染色液用pH6. 8的0.1mol/L PBS缓冲液配制，其中加入终浓度质量比5％的二甲基亚砜DMSO，终浓度5mmol/L的乙二醇二乙醚二胺四乙酸EGTA，终浓度质量体积比10％的蔗糖，再加入终浓度5μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽FITC-ph；8)染色：加入染色液，在室温黑暗条件下孵育0.5-1h；9)洗涤：用0. 1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，获得标记好的样品；10)封片：标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50％甘油封片观察。