[发明专利]一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法

权利要求书

1、一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括：

1)花粉的采集：采集开花当天的花粉，采集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密 封，-20℃低温保存；

2)花粉培养基按照质量比制备：

蔗糖，10％；聚乙二醇PEG 4000，15％；H₃BO₃，0.01％；Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.03％； MgSO₄·7H₂O，0.02％；KNO₃，0.01％；溶剂，水；用30mmol/L的2-(N-吗啉基)乙磺 酸MES缓冲液调pH值至6.5；

3)花粉的培养：

取步骤1)干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在恒温25℃黑暗条件下分别培养 0.5h或2h，培养0.5h的花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花 粉管，用于花粉管内微丝骨架的荧光标记与观察；

4)预固定：培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L顺 丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS预固定5-10min；

5)固定：然后用含有质量比2％多聚甲醛和质量比4％多聚甲醛、pH为6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液PBS室温条件下固定花粉或花粉管0.5h；0.1mol/L PBS缓冲液 的配制：NaH₂PO₄·2H₂O 2.964g和Na₂HPO₄·12H₂O 28.998g加蒸馏水定容至1000ml， pH6.8；

6)洗涤：用0.1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，去除清洗液；

7)染色液的配制：

染色液用pH6.8的0.1mol/L PBS缓冲液配制，其中加入终浓度质量比5％的二甲 基亚砜DMSO，终浓度5mmol/L的乙二醇二乙醚二胺四乙酸EGTA，终浓度质量体积 比10％的蔗糖，再加入终浓度5μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽FITC-ph；

8)染色：加入染色液，在室温黑暗条件下孵育0.5-1h；

9)洗涤：用0.1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，获得标记好的样品；

10)封片：标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50％甘油封片观察。

2、根据权利要求1所述的一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，其特征在 于：步骤4)用顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS预固定的时间为7min。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤8)孵育时间为1h。