[发明专利]一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法

说明书

一、技术领域

本发明是梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括蔷薇科木本果树花粉及 花粉管微丝骨架的荧光标记方法以及用该方法对花粉及花粉管微丝骨架进行显微镜 观察等内容，属于生物技术领域。

二、背景技术

微丝骨架是细胞骨架的一种，它主要由肌动蛋白组装的螺旋状多聚体和肌动蛋白 结合蛋白组成。微丝的组装和解聚与细胞的许多功能活动相关，如参与细胞形态建成、 细胞器的运动定位、胞质流动以及顶端生长等。花粉管作为有花植物受精过程中雄性 单位的载体，具有典型的顶端生长特性，因而成为生物技术领域中研究细胞极性生长 的理想模式系统，此外，花粉管对细胞间的相互作用以及信号传导研究也具有重要意 义。微丝骨架是花粉管的基本结构之一，在花粉管的顶端生长中起着重要作用，包括 花粉管生长过程中极性位点的建立、分泌小泡的运输、胞质流动以及顶端细胞壁的构 建，并且与Ca²⁺等信号分子密切相关，因而，花粉管是研究植物细胞微丝骨架的模式 材料。

对于花粉管中微丝骨架的分布至今仍然存在争议。目前，已有很多研究花粉管中 微丝骨架的方法，但这些方法大多需要去壁，且主要用于草本植物花粉管微丝骨架分 布的研究，而几乎没有对木本植物花粉及花粉管内微丝骨架开展过研究，尤其是对梨 等蔷薇科木本果树花粉和花粉管中微丝骨架进行标记的有效方法和技术还未见报道， 从而导致与梨等蔷薇科果树花粉管生长过程中相关的生物学研究相对滞后。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的是提供一种较快速、有效的梨花粉及花粉管微丝骨架的 荧光标记方法，有效地对微丝骨架在花粉(管)内的结构与分布进行观察。该方法可 用于标记其他蔷薇科木本果树(苹果、桃、杏、李等)花粉(管)内微丝骨架，也为 其他组织器官内微丝骨架的荧光标记与观察提供方法。

技术方案 本发明所提供的对梨花粉及花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法，包 括下列步骤：

1)花粉的采集：采集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密封，-20℃低温保存；

2)花粉培养基按照质量比制备：

蔗糖，10％；PEG4000(聚乙二醇4000)，15％；H₃BO₃，0.01％；Ca(NO₃)₂·4H₂O， 0.03％；MgSO₄·7H₂O，0.02％；KNO₃，0.01％；溶剂，水；用30mmol/L的MES缓冲液 (2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液)调pH值至6.5；

3)花粉的培养：

取步骤1)干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在恒温25℃黑暗条件下分别培养 0.5h或2h，培养0.5h的花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花 粉管，用于花粉管内微丝骨架的荧光标记与观察；

4)预固定：培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L MBS (顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定5-10min；

5)固定：然后用含有质量比2％多聚甲醛和质量比4％多聚甲醛、pH为6.8的0.1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)室温条件下固定花粉或花粉管0.5h；0.1mol/L PBS 缓冲液(磷酸缓冲液)的配制：NaH₂PO₄·2H₂O 2.964g和Na₂HPO₄·12H₂O 28.998g加 蒸馏水定容至1000ml，pH 6.8；

6)洗涤：用0.1mol/LPBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗2-3次，去除清洗液；

7)染色液的配制：

染色液用pH6.8的0.1mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)配制，其中加入终浓度 质量比5％ DMSO(二甲基亚砜)，终浓度5mmol/L EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)， 终浓度质量体积比10％蔗糖，再加入终浓度5μg/ml FITC-ph(异硫氰酸荧光素标记 的鬼笔环肽)；

8)染色：加入染色液，在室温黑暗条件下孵育0.5-1h；

9)洗涤：用0.1mol/LPBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗2-3次，获得标记好的样 品；

10)封片：标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50％甘油封片，待观察。